优秀研究生答辩幻灯片-.ppt

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1、 FSP-1通过notch信号参与慢性肾病AVF的机制研究汇报人：曾惜材料与方法材料与方法研究目的研究目的结结 论论讨讨 论论结结 果果研研究背景究背景目目录录C o n t e n t sC o n t e n t s我将从以下几个方面向大家介绍我的研究论文。首先是研究背景单击研研究背景究背景 Research BackgroundResearch Background慢性肾脏病(ChronicKidneyDielace，CKD),即各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍的疾病。近20年来，由于患病率高、防治率低、病因谱发生显著变化（糖尿病、高血压等人数迅速上升），已成为继心脑血管病、肿瘤、糖

2、尿病之后的一个威胁人类健康重要疾病。 血液透析与动 静 脉 內 瘘 研研究背景究背景 Research BackgroundResearch Background血液透析（hemodialysis，HD）是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之一，它能建立和维持的一个有足够功能的血管通路(vascularaccess)，即动静脉内瘘(AVF)。自体动静脉内瘘是目前终末期肾脏病（ESRD，即尿毒症）患者进行透析治疗时应用最广泛的慢性血管通路,是保证透析顺利进行和提高患者生存质量的关键。但是，内瘘的使用过程中会因为血栓形成或内膜增生等导致失败。血管内膜增生 2、动脉平滑肌细胞（SMC）的 迁移、异

3、常分化4、血管重构, AVF狭窄3、血管内膜SMC增生、 细胞外基质沉积 自体动静脉内瘘功能障碍 1、 内皮细胞(EC)损伤研研究背景究背景 Research BackgroundResearch Background人的FSP-1基因包含4个外显子，2种剪切体。FSP-1启动子区域含有一个ERBB2反应元件，其转录受位于第1内含子的正性和负性调节元件的调节。其转录沉默与其甲基化有关。FSP-1即成纤维细胞特异性蛋白-1(Fibreblastspecificprotein1)，又称为钙结合蛋白A4（S100A4），为S100家族中的一个重要成员。是由101个氨基酸组成的多肽,分子量为11.5k

4、D，含有2EF-hand钙离子结合结构域。成纤维细胞特征性标记，用于鉴定各种器官纤维化进程中发生的间质化FSP-1具有很强的促血管生成作用，对血管生成有直接的促进作用，几乎参与了肿瘤发生、发展及转移的整个病理生理过程。通过钙离子信号转导途径可在细胞增殖、分化、肌肉收缩、基因表达、分泌以及凋亡中发挥重要作用。FSP-1调节SMC迁移，促进血管内膜增生FSP-1成纤维细纤维细胞特异性蛋白-1研研究背景究背景 Research BackgroundResearch Background研研究背景究背景 Research BackgroundResearch Background小鼠实验研究发现，No

5、tch信号通路是调节血管内皮细胞功能和血管新生的关键。激活的Notch/RBP-Jk信号可以增强由CDK引起的血管内膜增生。同时，Notch信号通路可以调控血管重塑，抑制了Notch信号或者敲除RBP-Jk，都可以下调FSP-1的表达，阻止平滑肌细胞的迁移，从而抑制血管内膜增生TGF-,活化notch信号DAPT,r-分泌酶抑制剂，抑制Nnotch信号通路途径可概括为：DeltaNotch酶切ICN进入细胞核CLS-ICN复合体基因转录。Notch信号通路材料与材料与方法方法研究目的研究目的结结 论论讨讨 论论结结 果果研研究背景究背景研究目的Research Objective材料与材料与方

6、法方法 Materials and methodslReporterAssaylEMSAlChIP1、启动子区域的确定生物信息学预测启动子区域缺失突变 荧光素酶活性分析克隆5-flankingsequence并连接到报告基因载体上确定转录调控区域（启动子区域）材料与材料与方法方法 Materials and methods材料与材料与方法方法 Materials and methods生物信息学预测启动子区域RBP-jkconsensussequenceinFSP-1promoterlocation consensus sites -1832 to -1826 ctcccac-1568 to

7、-1562 atgggaa-1460 to -1454 tttccac-1452 to -1446 gcGggaa-1414 to -1408 gagggaa-1357 to -1351 gtgggga-1198 to -1192 gtgggag-815 to -709 ttcccac-692 to -686 tccccac-366 to -360 ctcccac-178 to -172 tacccac-168 to -162 tgcccac-161 to -155 ctgggaaPCR+HindIII+EcoRVHindIII+EcoRV提取基因组FSP-1启动子区序列TAK101-t-ve

8、ctorpGL4-basicvectorTAK101-t-FSP-1pGL4-basicFSP-1pGL4-FSP-1FSP-1启动子区荧光素酶报告载体构建材料与材料与方法方法 Materials and methods材料与材料与方法方法 Materials and methods荧光素酶活性分析材料与材料与方法方法 Materials and methods：突变位点：缺失突变引物PCR5335：同源序列未突变的用DpnI甲基化酶消化NotTransformed转化m自身连接酶切位点plasmidofpGL4-C缺失突变材料与材料与方法方法 Materials and methods凝胶迁

9、移阻滞实验(EMSA)EMSA是一种在体外研究蛋白质与核酸相互作用的技术，可用于定性和定量分析。仅以DNA与蛋白质相互作用为例介绍EMSA材料与材料与方法方法 Materials and methods凝胶迁移阻滞实验(EMSA)材料与材料与方法方法 Materials and methodsChIP是研究细胞内基因组DNA的某一区域与特定蛋白质包括组蛋白和非组蛋白（如转录因子）相互作用的有效方法。ChIP（染色质免疫共沉淀）材料与材料与方法方法研究目的研究目的结结 论论讨讨 论论结结 果果研研究背景究背景结结 果果R e s u l t1、FSP-1启动子区PCR扩增2、重组质粒构建酶切连接

10、，转化菌液电泳提质粒TA克隆 3、pGL4-FSP-1系列质粒鉴定PCR+酶切FSP-1启动子区荧光素酶报告载体构建结结 果果R e s u l tCompare with D各时间点氧合指数比较Compare with T0Compare with T0结结 果果R e s u l t各组兔肺组织SOD活性和MDA含量的比较结结 果果R e s u l tCompare with DCompare with DCompare with left lungCompare with left lungCompare with OCompare with OOO组右侧组右侧U U组右侧组右侧各组肺

11、组织病理学结果D D组右侧组右侧OO组左侧组左侧D D组左侧组左侧U U组左侧组左侧400350300250200150100500D组O组U组右肺左肺D组双侧肺组织肺泡结构基本完整，肺泡腔内无明显渗出、出血、间质增厚、炎性细胞浸润；O组左侧肺组织肺泡结构破坏，肺泡腔内少量渗出物，少量出血，间质轻度增厚，炎性细胞浸润较少。O组右侧肺组织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内有渗出较多，出血多，间质明显增厚，炎性细胞较多；U组左右侧肺组织比O组左右侧肺组织损伤程度轻。将上述图片进行根据病理损伤评分，得出数据显示：长时间单肺通气肺组织mtTFA表达下调。2、乌司他丁具有减轻单肺通气损伤，与上调肺组织mtTF

12、A表达有关1、长时间单肺通气肺组织病理学损伤评分升高。2、与单肺通气组比较，乌司他丁组肺组织病理学损伤评分下降。结结 果果R e s u l tcomparewithlunginjuryscoresingroups结果表明：与D组相比，O组肺组织mtTFA表达降低；与O组肺组织相比较，U组肺组织mtTFA表达升高O O组右侧组右侧U U组右侧组右侧D D组右侧组右侧O O组左侧组左侧D D组左侧组左侧U U组左侧组左侧400350300250200150100500D组O组U组左肺右肺免疫组化法测定各组肺组织mtTFA表达结结 果果R e s u l tWestern blot结果以密度扫描分

13、析：采用美国 Bandscan 5.0软件对Westernblot结果进行定量分析，灰度值以累积光密度值（IOD）表示，结果通过以下公式计算：mtTFA蛋白累积光密度值GAPDH的累积光密度值mtTFA蛋白半定量 = DL DR OL OR UL URWestern blot法检测各组肺组织mtTFA表达mtTFA表达GAPDH结果表明：与D组相比，O组肺组织mtTFA表达降低；与O组左侧肺组织相比，O组右侧肺组织mtTFA表达降低；与O组肺组织相比较，U组肺组织mtTFA表达升高。与免疫组化法测定mtTFA结果一致。D组O组U组结结 果果R e s u l t左肺右肺Theexpressio

14、nleveloflungtissuemtTFAwasmeasuredbywesternblotindifferentgroups.材料与材料与方法方法研究目的研究目的结结 论论讨讨 论论结结 果果研研究背景究背景研究表明，氧合指数300 mmHg(1mm Hg=0.133 kPa)时即可认为发生肺损伤。O组、U组通气结束时氧合指数300mmHg，提示氧饱和下降，出现轻微的低氧血症。光镜下单肺通气后肺组织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内有渗出，出血多，间质增厚，炎性细胞大量聚集。综合肺组织病理学结果及血气分析结果，O组、U组通气结束时氧合指数300mmHg，氧饱和下降，出现轻微的低氧血症，提示兔单肺

15、通气诱发肺损伤模型制备成功。乌司他丁减轻肺损伤机制 肺损伤时肺组织脂质过氧化反应及与mtTFA关系 单肺通气致肺损伤的机制单肺通气诱发肺损伤模型的制备讨讨 论论 Discussion动脉血氧合指数比较： O组、U组通气结束时氧合指数300mm Hg，提示氧饱和下降，出现轻微的低氧血症。肺组织病理学损伤评分：光镜下单肺通气后肺组织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内渗出，出血多，间质增厚明显，炎性细胞聚集。研究表明，氧合指数300 mmHg(1mm Hg=0.133 kPa)时即可认为发生肺损伤。 本研究结果表明：O组、U组通气结束时氧合指数3分为重度损伤本研究结果表明，光镜下单肺通气后肺组织大部分肺泡

16、结构消失，肺泡腔内渗出，出血多，间质增厚明显，炎性细胞聚集。单单 肺肺 通通 气气 诱诱 发发 肺肺 损损 伤伤 模模 型型 的的 建建 立立讨讨 论论 Discussion研究表明，氧合指数300 mmHg(1mm Hg=0.133 kPa)时即可认为发生肺损伤。本研究结果表明，O组、U组通气结束时氧合指数3分为重度损伤光镜下单肺通气后肺组织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内有渗出，出血多，间质增厚，炎性细胞大量聚集。综合肺组织病理学结果及血气分析结果，O组、U组通气结束时氧合指数300mmHg，氧饱和下降，出现轻微的低氧血症，提示兔单肺通气诱发肺损伤模型制备成功。单肺通气诱发肺损伤模型制备成功单肺通气诱发肺损伤模型制备成功单 肺 通 气 诱 发 肺 损 伤 机 制 单肺通气诱发非通气侧肺损伤比通气侧严重本研究结果表明，与O组左侧比较，O组右侧肺组织肺损伤评分升高、SOD活性降低、MDA含量升高、mtTFA表达下调。提示非通气侧肺组织损伤严重，其机制可能为非通气侧肺组织长时间萎陷，肺泡型细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性较肺通气侧明显下降，阻碍肺泡间质内的肺水重吸收，因此肺泡内渗出液增多。