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1、ICS点击此处添加中国标准文献分类号DB地方标准DB 36/ 2021629饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程Technical regulations of breeding of chrysanthemum virus-free seed seedlings点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：2021年12月）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施江西省市场监督管理局发布DBXX/ XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14一般性要求25网室建造与隔离26原种苗生产3附录A6前言本标准按照GB/T 1.1-2020标准化
2、工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及本专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准由江西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。本标准主要起草人：汤泳萍、罗绍春、叶艳英、张冰冰、周劲松、尹玉玲、程正新、谢启鑫。IIDBXX/ XXXXXXXXX饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程1 范围本标准规定了饮用菊花（Chrysanthemum morifolium (Ramat.) TzveL.）脱毒原种苗的繁育技术要求和规程。本标准适用于常见饮用菊花脱毒原种苗的生产。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可
3、少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19165-2003 日光温室和塑料大棚结构与性能要求GB/T8321 （所有部分）农药合理使用准则NY/T 1224-2006 农用塑料薄膜安全使用控制技术规范NY/T 391 -2021绿色食品 产地环境质量NY/T 496 -2021肥料合理使用准则 通则NY/T 1657-2008 花卉脱毒种苗生产技术规程NY/T 1591-2008 菊花切花种苗等级规格NY/T5121-2002 无公害食品饮用菊花生产技术规程NY/T525-2021 有机肥料3 术语和定
4、义下列术语和定义适用于本文件。3.1 饮用菊花脱毒种苗 （Drink chrysanthemum virus-free seedlings）指经RT-PCR检测方法鉴定，确认脱除了菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、黄瓜花叶病毒（CMV）等的脱毒核心材料（或脱毒苗）在隔离条件下生产的原原种苗、原种苗。 3.2 原原种苗 （breeder seed） 指经组织培养过程直接获得的种苗。3.3 原种苗 （foundation seed）是指原原种苗繁殖的第一代苗。4 一般性要求4.1 产地环境 产地环境符合 NY/T 391-2021的规定。4.2 场地要求 选择排灌方便，地下水位较低，土
5、层深厚、肥沃、疏松，3年内未种过茄科作物，中性或微酸性土壤地块种植。4.3 化学农药使用 应符合GB/T8321（所有部分）的要求。4.4 肥料要求 应符合NY/T496-2021和 NY/T525-2021的要求。5 网室建造与隔离一般宜南北向建造，钢架结构，大棚单体大棚宽8m，顶高不低于2.8m，连体棚可23联体，棚宽8m为宜，大棚肩高不低于1.5m，连体大棚宜在中间拱顶上分布避雨天窗散热。大棚长度可依据地形确定，最长不超过50m。大棚所有通风处安装60目防虫网。大棚搭建应符合GB 19165-2003要求，大棚覆盖薄膜应符合NY/T 1224-2006要求。大棚入口处宜配套缓冲间，田间操
6、作人员进入防虫温、网室应更换工作衣和鞋具。6 原种苗生产6.1 原原种苗生产6.1.1 材料和培养基准备选具有繁育品种典型性状、生长健壮的植株，至光照培养箱中采用变温升温的方式进行热处理，在日温/夜温分别为26 /20 下培养2d后，而后每2d昼/夜温度分别升高2 ，直至38 /30 ，该温度下培养40d，取高温培养长出的茎段，剪去叶片，留取心叶或腋芽，放在烧杯中，用肥皂水冲洗干净，再用自来水冲洗1h。滤干，移入无菌操作台，用20%的次氯酸钠灭菌8min10min，取出后用无菌水冲洗35次，待用。将制备好的MS+6-BA0.1mg/L培养基溶液分装于培养瓶，每瓶30ml，瓶口盖紧瓶盖。在121
7、 ，1.1 MPa条件下灭菌20min，冷却后放入无菌操作台待用。6.1.2 分化和继代培养在无菌条件下，在解剖镜下剥取已灭菌材料的生长点0.3mm0.5mm，接种到已灭菌的培养基上，置于26，光强2000lx3000lx，光照时间16h/d条件下培养，一周左右茎尖转绿并萌动，20d30d形成带芽茎段。在无菌条件下将已分化的带芽茎段剪成小段，每段带12个腋芽，转入培养基（MS+6-BA 0.1 mg/L）中进行增殖，34周后获3040个带腋芽芽段。6.1.3 病毒检测 取继代培养壮芽或叶片提取RNA，经RT-PCR检测方法鉴定，如没有病毒则继续培养，脱毒不彻底则弃之不用。具体操作见附录A。6.
8、1.4 生根培养及炼苗移栽6.1.4.1 生根培养将继代培养的茎段转入生根培养基（MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L）诱导生根，培养温度2526，34周后95%均生根。6.1.4.2 炼苗移栽瓶苗株高6cm7cm，56片平展叶，生根5条以上3cm4cm长的根时即可炼苗，幼苗炼苗1d2d后，定植在营养钵或苗床，于具60目防虫网的防虫网室或防虫温室内进行培育。6.1.4.3 移栽管理原原种苗采用9cm9cm营养钵或苗床移栽，珍珠岩+蛭石+泥炭按体积比111的比例混合做基质，移栽前用广谱保护性杀菌剂喷洒消毒。移栽后浇透定根水，以后保持基质70%的持水量，空气湿度保持在80%90
9、%。太阳光强时要注意采用遮阳网遮荫。当植株发新叶后，逐步恢复自然光照，并进行叶面施肥。气温不足时采取小拱棚膜和大棚相结合的双膜覆盖方式。白天保持2526，夜间1820。成活后白天保持2527，夜间1618，注意控水降温，防止幼苗徒长。移栽前一周注意揭膜通风炼苗。6.2 脱毒原原种苗的性状观察 随机抽取每个无性系脱毒苗510株，以其母株为对照一起种植至开花。观察比较其主要生物性状，与母株无差异者则可确认为原原种苗，有差异则淘汰整个无性系。6.3 原种苗网室中繁殖6.3.1 原种繁育田环境原种繁育田要求育苗环境除应符合NY/T 391-2021的规定外，要选择排灌方便、地下水位较低，地势高燥，土层
10、深厚、肥沃、疏松，阳光充足，通风条件好，3年内未种过茄科植物，5年内未种过菊科植物的中性或微酸性土壤地块，且周围800m范围内无其它菊科和茄科植物种植。6.3.2 苗床整理、消毒育苗地于冬前深耕晒垡，每667m2施入完全腐熟的农家肥500kg，扦插前一周左右平整土地，清除杂草，畦面做到平、细、碎。育苗畦高25cm30cm，畦面宽100cm，畦间距40cm。苗床四周开宽50cm的深沟，便于排水。苗床消毒每平方米用70%甲基托布津可湿性粉剂8g兑水1000倍，菌线威0.3g0.5g兑水35007000倍，均匀喷洒畦面上预防杂菌和根结线虫病。再用茶枯饼0.03 kg驱赶地下害虫。在整平的畦面上均匀铺
11、上5cm10cm厚的河沙。6.3.3 定植、剪顶、腋芽扦插原种苗母株定植行株距应为45cm45cm，便于除草和施基肥。从炼苗移栽成活的原原种苗上取健壮枝条扦插于苗床上，于网室中扩繁。当原种苗母株长到78片叶时，从基部留34片叶处剪下顶芽进行扦插。6.3.4 原种苗越冬和田间管理在原种基地扩繁种苗需周年进行，当温度低于0时，需要搭小拱棚，盖上薄膜保温。当母株苗越冬后，要及时掀开薄膜，中耕除草，松土保墒。苗高7cm8cm时，要开沟施1次复合肥。施用肥料应符合 NY/T 496-2021 和 NY 525-2021 规定。具体田间管理参照NY/T 1657-2008和NY/T5121-2002操作，
12、经过一年生产和集中繁育，繁育出健壮原种苗。6.4 脱毒原种苗质量检测脱毒原种苗质量检测参照NY/T 1591-2008中5.1.3进行抽样检查，并按照NY/T 1591-2008中5.2的内容进行检测，确定种苗的质量等级。附录A（规范性附录）RNA病毒的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法A.1主要仪器设备与试剂、耗材表1 各步骤主要仪器设备与试剂、耗材步骤/类别主要仪器设备主要试剂盒与试剂（试剂均使用分析纯试剂）主要耗材RNA提取高压灭菌锅、电子天平、高速冷冻离心机、微量移液器、微量核酸测定仪RNA提取试剂盒：TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction
13、Kit试剂：无水乙醇、液氮无RNA酶的离心管（1.5mL， 2mL）、移液器配套枪头、配套枪头盒、研钵、研棒、PE手套、乳胶手套第一链cDNA合成水浴锅、制冰机、PCR扩增仪器反转录试剂盒：PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit无RNA酶PCR管和枪头、乳胶手套PCR扩增PCR扩增仪器、制冰机微量移液器、微量离心机Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye) 、引物、矿物油无RNA酶PCR管和枪头、乳胶手套凝胶电泳电子天平、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统琼脂糖、1 TAE缓冲液、 DNA M
14、arker三角瓶、量筒、制胶板、梳子、乳胶手套A.2 操作步骤A.2.1 菊花总RNA的提取RNA提取按照试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）Protocol-II的说明书 进行。用1.0%的琼脂糖凝胶对总RNA提取结果进行电泳检测，利用微量核酸测定仪检测RNA浓度，测量A260与A280值。A.2.2 第一链cDNA合成按照反转录试剂盒（PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）说明书进行。A.2.3 PCR扩增及电泳（1）PCR 反应体系PCR反应体系： 总体积10L，其中0.4L上游引物
15、（ 10mM）， 0.4L下游引物（ 10mM）， 5L Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)（0.05U/l）， 1LcDNA模板（ 20ng/L），3.2Ldd H2O。（2）PCR反应程序PCR反应程序：1）94 预变性4min；2）94 变性45s；3）按表A.4 推荐的引物退火温度退火45s；4）72 延伸45s；5） 重复步骤2）4），共35个循环；6）72延伸7min；7）4 保存。（3）PCR扩增产物电泳检测配制1.0%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，电泳液浸没胶面1mm。样品沿着胶孔边缘匀速加入。接通电源，选择合适的电压和时间电泳。电泳结束后，胶块置于紫外成像系统中，调整拍摄
