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1、 高通量测序分析黑土稀有微生物群落结构 关健飞 曹阳摘要：稀有微生物群落作为地球生态系统中的重要组成部分，在土壤生态系统中扮演着超比例的角色。以黑龙江省黑土中稀有微生物为研究对象，采用高通量测序技术分析黑土中稀有细菌、真菌群落结构组成及其与土壤理化性质的相关性。对属水平上稀有微生物群落进行分析发现，相对丰度在0.01%以下的稀有细菌菌属420种，稀有真菌菌属210种，各采样点处稀有微生物类群分布差异性较大，存在特征稀有微生物类群，但未见黑土共有稀有菌属的检出。总磷和有效磷的含量分别影响不同种类的稀有细菌菌属，其中放线孢菌属（Actinomycetospora）与总磷含量呈现极显著正相关关系，无
2、色杆菌属（Achromobacter）与有效磷含量呈现极显著正相关关系。真菌稀有菌群中的小孢霉属（Microbotryum）、顶孢霉属（Acremonium）等与土壤含水率、有机质含量、总氮含量、硝态氮含量呈现极显著正相关关系。关键词：稀有微生物;群落结构;高通量测序;黑土;理化性质： S154.3 文献标志码： A ：1002-1302（2020）20-0288-05微生物作为土壤生态系统的重要组成部分，在维持生态系统功能和服务过程中起着关键作用1。现阶段对于土壤微生物的研究主要集中在物种组成、结构功能以及遗传多样性等方面。土壤中的微生物群落具有典型的物种丰度分布偏斜特征，表现为相对高丰度的
3、少量优势物种与相对低丰度的大量稀有物种共存2，稀有群落作为地球生态系统中至关重要的组成部分，在土壤生态系统中扮演着超比例的角色3，是微生物群落功能的一个潜在驱动力4，稀有微生物群落是评价微生物多样性的重要因素，是微生物遗传和功能多样性的存储库，具有驱动地球化学循环5-6、指示环境变化7-8、降解污染物9-10、稳定群落结构11等重要功能。然而相对于优势类群，现阶段对于稀有微生物类群的研究较少12。本研究以黑龙江省黑土为研究对象，解析土壤中稀有细菌和真菌的群落结构组成，分析稀有微生物群落与土壤理化性质的相关性，为稀有微生物的生态学研究奠定基础。1 材料与方法1.1 土壤样品采集本研究以黑龙江省表
4、层（020 cm）黑土为研究对象，在黑龙江省区域内设置10个采样点（图1），于2019年5月进行土壤样品采集。土壤样品采集过程中去除细根等杂物后，充分混匀，置于密封袋，带回实验室后，-80 保存土壤样品用于高通量测试分析，常温风干土壤样品用于理化性质测定。1.2 高通量测序采用Illumina MiSeq测序平台对测序样本进行双端测序，委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。测序过程中，采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤总DNA。采用细菌16S rRNA基因V3-V4区引物515F（5-GTGCCAGC
5、MGCCGCGG-3）和907R（5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3）对高变区片段进行扩增，PCR反应条件为95 预变性3 min;27次循环（95 变性30 s，55 退火 30 s，72 延伸45 s）;72 延伸10 min，10 保存。20 L反应体系为4 L的5FastPfu Buffer，2 L的2.5 mmol/L dNTPs，0.8 L的Forward Primer（5 mol/L），0.8 L的Reverse Primer（5 mol/L），0.4 L的FastPfu Polymerase，0.2 L的BSA，10 ng的Template DNA，补ddH2O至
6、20 L。真菌18S rDNA的V5-V7区引物SSU0817F（5-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3）和1196R（5-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3）对高变区片段进行扩增，PCR反应条件为90 预变性3 min;37次循环（95 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸45 s）;72 延伸10 min，10 保存。20 L反应体系为 4 L的5FastPfu Buffer，2 L的2.5 mmol/L dNTPs，0.8 L的Forward Primer（5 mol/L），0.8 L 的Reverse Primer（5 mol/L），0.4 L的Fa
7、stPfu Polymerase，0.2 L的BSA，10 ng的Template DNA，补ddH2O至20 L。利用QuantiFluorTM-ST微型荧光计进行PCR产物检测定量。测序数据经过barcode拆分后获得的有效序列信息统计，使用Qiime2软件中的DADA2插件对所有样品的全部原始序列进行质量控制、去噪、拼接并且去嵌合体，形成OTU。1.3 土壤理化性质测定土壤含水率的测定采用真空烘箱法;pH值的测定采用电位法;有机质含量的测定采用重铬酸钾滴定法;全氮含量的测定采用半微量开氏法;全磷含量的测定采用氢氧化钠碱融-钼锑抗比色法;全钾含量的测定则采用火焰光度法;硝态氮含量采用连续流
8、动分析仪法进行测定;有效磷含量采用钼锑抗比色法进行测定，其中酸性土壤使用氟化铵-盐酸作为浸提剂，碱性土壤使用碳酸氢钠作为浸提剂;速效钾含量则使用乙酸铵浸提-火焰光度计测定，每个土壤样品测3次取平均值记录，用于后续试验数据的分析。1.4 数据处理方法选取代表性OTU序列，与核糖体RNA数据库（Greengenes Database 13_8版本按99%序列相似性聚類）进行比对获得物种注释信息。使用Excel 2010、Origin 8.0对数据进行处理以及作图分析，使用SPSS 19.0进行土壤理化性质和稀有细菌、真菌菌群的Pearson相关性分析以及各采样点的细菌、真菌聚类分析，本研究中细菌和
9、真菌菌属稀有性的定义为小于0.01%的相对丰度13。4Jousset A，Bienhold C，Chatzinotas A，et al. Where less may be more：how the rare biosphere pulls ecosystems stringsJ. ISME Journal，2017，11（4）：853-862.5Zhang Y，Dong S K，Gao Q Z，et al. “Rare biosphere” plays important roles in regulating soil available nitrogen and plant biomas
10、s in alpine grassland ecosystems under climate changesJ. Agriculture Ecosystems & Environment，2019，279：187-193.6Philippot L，Spor A，Hnault C，et al. Loss in microbial diversity affects nitrogen cycling in soilJ. The ISME Journal，2013，7（8）：1609-1619.7Jiao C C，Zhao D Y，Huang R，et al. Abundant and rare b
11、acterioplankton in freshwater lakes subjected to different levels of tourism disturbancesJ. Water，2018，10（8）：1075.8Wang Y Q，Hatt J K，Tsementzi D，et al. Quantifying the importance of the rare biosphere for microbial community response to organic pollutants in a freshwater ecosystemJ. Applied and Envi
12、ronmental Microbiology，2017，83（8）：e03321-16.9Wei S T S，Wu Y W，Lee T H，et al. Microbial functional responses to cholesterol catabolism in denitrifying sludgeJ. mSystems，2018，3（5）：e00113-e00118.10Giebler J，Wick L Y，Chatzinotas A，et al. Alkane-degrading bacteria at the soil-litter interface：comparing i
13、solates with T-RFLP-based community profilesJ. FEMS Microbiology Ecology，2013，86（1）：45-58.11Vivant A L，Garmyn D，Maron P A，et al. Microbial diversity and structure are drivers of the biological barrier effect against Listeria monocytogenes in soilJ. PLoS One，2013，8（10）：e76991.12Lynch M D J，Neufeld J
14、D. Ecology and exploration of the rare biosphereJ. Nature Reviews Microbiology，2015，13（4）：217-229.13Galand P E，Casamayor E O，Kirchman D L，et al. Ecology of the rare microbial biosphere of the Arctic OceanJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（52）：
15、22427-22432.14Musat N，Halm H，Winterholler B，et al. A single-cell view on the ecophysiology of anaerobic phototrophic bacteriaJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（46）：17861-17866.15Liu M，Xue Y Y，Yang J. Rare plankton subcommunities are far more a
16、ffected by DNA extraction kits than abundant planktonJ. Frontiers in Microbiology，2019，10：454.16Hu B Y，Xu B X，Yun J L，et al. High-throughput single-cell cultivation reveals the underexplored rare biosphere in deep-sea sediments along the Southwest Indian RidgeJ. Lab on a Chip，2020，20：363-372.17Hamas
