雾化吸入和腹腔注射依达拉奉对烟雾吸入性损伤肺模型大鼠保护作用的比较研究 肖长栓 刘娅平 杨景哲摘 要 目的：比較雾化吸入和腹腔注射依达拉奉对烟雾吸入性肺损伤模型大鼠急性肺损伤的保护作用方法：将30只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为正常对照组（A组）、致伤空白组（B组）、致伤腹腔注射治疗组（C组）和致伤低、高剂量雾化吸入治疗组（D、E组），每组6只B～E组大鼠均被置于含松木屑的烟雾发生器中复制烟雾吸入性肺损伤模型;A组大鼠除不放松木屑外，其余操作同上造模后30 min，C组大鼠腹腔注射依达拉奉18 mg/kg（每间隔70 min重复1次，共4次）;D、E组大鼠雾化吸入依达拉奉9、18 mg/kg（雾化吸入10 min，每间隔60 min重复1次，共4次）;A、B组大鼠不作任何处理末次给药后6 h，进行大鼠动脉血气分析，并计算大鼠肺湿干比（W/D）和肺组织含水率;采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测其血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、IL-10含量;采用ELISA等方法检测其肺组织中丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）含量;采用苏木精-伊红染色法观察其肺组织病理改变;采用TUNEL法检测其肺组织细胞凋亡率。
结果：A组大鼠肺组织未见异常;B组大鼠肺组织中可见出血及水肿，肺泡结构难以辨认，并可见炎症细胞和红细胞浸润;C～E组大鼠肺组织上述症状均有不同程度改善与A组比较，其余组大鼠动脉氧分后和吸入氧浓度比值（PaO2/FiO2）以及肺组织SOD含量均显著降低（P<0.05）结论：依达拉奉对烟雾吸入性肺损伤模型大鼠具有一定的保护作用，可剂量依赖性地减少炎症介质和（或）细胞因子的产生及释放、减轻过氧化损伤并抑制细胞凋亡，且雾化吸入较腹腔注射的效果更明显关键词 雾化吸入;腹腔注射;依达拉奉;吸入性肺损伤;量效关系;大鼠;保护作用;炎症因子ABSTRACT OBJECTIVE： To compare the protective effect of atomization inhalation and intraperitoneal injection of edaravone on acute lung injury in smoke inhalation lung injury model rats. METHODS： Thirty male SD rats were divided into normal control group （group A）， injury group （group B）， intraperitoneal injection group （group C）， low-dose aerosol inhalation group （group D）， high-dose aerosol inhalation group （group E） according to random numble table， with 6 rats in each group. Group B-E were placed in smoke generator containing pine sawdust to induce smoke inhalation lung injury model. In group A， the operation was the same as above except that the pine sawdust was not placed. Thirty minutes after modeling， group C were injected intraperitoneally with edaravone 18 mg/kg （every 70 min， 4 times in total）. Group D and E inhaled edaravone 9， 1.8 mg/kg （every 60 min， lasting for 10 min each time， 4 times in total）. The rats were treated by no means in group A and group B. Six hours after last medication， arterial blood gas analysis was performed， and the lung wet to dry ratio （W/D） and water content of lung tissue were calculated. The levels of TNF-α， IL-6 and IL-10 in serum were detected by double antibody ELISA. The contents of MDA， MPO， SOD and Caspase-3 in lung tissue were determined by ELISA and other methods. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. The apoptotic rate of cells in lung tissue were determined by TUNEL assay. RESULTS： No abnormality was found in lung tissue of group A; in group B， hemorrhage and edema were found in lung tissue， alveolar structure was difficult to identify， and inflammatory cells and red blood cell infiltration were seen. Above symptoms of rats in group C-E were improved to different extent. Compared with group A， PaO2/FiO2 and SOD content of lung tissue were decreased significantly in other groups （PKEYWORDS Atomization inhalation; Intraperitoneal injection; Edaravone; Smoke inhalation lung injury; Dose-effect relationship; Rats; Protective effect; Inflammation factor近年来有数据显示，各种火灾事故所致死亡的人员中，有75%被证实合并不同程度的吸入性损伤[1]。
吸入性损伤是发生在呼吸道及肺实质、因热力和（或）烟雾造成的一种烧伤严重合并症，具有病情危重、发病隐匿等特点[1]研究表明，吸入性肺损伤发病机制较复杂，可能与热力/烟雾等致伤因素激活肺部炎症细胞后分泌某些炎症介质及细胞因子，导致失控性炎症反应发生，产生大量氧自由基，继而启动系统性炎症反应综合征（SIRS）有关，严重时可引发呼吸窘迫综合征（ARDS）以及多器官功能障碍综合征（MODF），严重危害人体健康[2]对于吸入性肺损伤，临床现多采用气管切开及灌洗、机械通气等介入综合治疗措施，但多因治疗费用昂贵、收效甚微而被人们诟病;此外，国内外学者还进行了相关药物的体内研究，但其安全性及有效性欠佳[3]因此，寻找可靠的干预手段以有效减轻吸入性肺损傷的原发性炎症反应及继发性损害成为当前研究的热点之一目前，多种抗炎及抗氧化剂被广泛应用于动物研究和临床治疗中，其中依达拉奉是近年来较为常见的一种新型氧自由基清除剂研究表明，该药可通过抑制脂质过氧化及调节炎症因子分泌、抑制细胞凋亡等途径来发挥神经系统保护作用[4]多项研究表明，依达拉奉在多种原因导致的急性肺损伤中均显示出积极的作用[5-6]，但将该药用于改善烟雾吸入性肺损伤，目前国内外报道较少。
此外，依达拉奉具有较好的亲脂性，且分子量小，故能较容易地透过细胞膜渗入局部组织器官及动静脉并获得良好的组织及血管内药物浓度[7]，加之雾化吸入方式可使药物直达靶器官，因此笔者推测给药方式的改变可能更有利于肺保护基于此，本研究拟通过早期雾化吸入不同剂量及腹腔注射高剂量依达拉奉对烟雾吸入性肺损伤模型大鼠进行干预，比较两种给药方式对烟雾吸入性肺损伤的保护作用并探讨其可能机制，以期为临床治疗提供实验依据和新思路1 材料1.1 仪器MHY-27127型烟雾发生器（北京美华仪科技有限公司）;ABL-800型血气分析仪（丹麦Radiometer公司）;PARI Turbo BOY N型系列雾化机（德国PARI GmbH公司）;ELX800UV型酶标检测仪（美国BioTek公司）;Centrifuge5702型离心机（德国Eppendorf公司）;CK40型光学显微镜（日本Olympus公司）;KD-BM型生物组织包埋机（浙江金迪科迪仪器设备有限公司）;RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司）1.2 药品与试剂依达拉奉原料药[双鹤药业（商丘）有限责任公司，批号：19042011，纯度：99.7%];苏木精-伊红（HE）染色液（安徽雷根生物技术有限公司，批号：20191010）;免疫染色强力通透液、脱氧核糖核苷酸末端转移酶反应液（北京百奥莱博科技有限公司，批号分别为20191008、20191011）;大鼠白细胞介素6（IL-6）、IL-10、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国R&D公司，批号分别为20180505、20180308、20180401、20180305）;大鼠丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20171213、20171214、20171212、20171224）;TUNEL检测阳性对照制备试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司科技发展公司，批号：20171020）;其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
1.3 动物清洁级雄性SD大鼠，60日龄，体质量约200 g，由中国食品药品检定研究院提供，动物生产许可证号：SCXK（京）2017-0005所有大鼠均饲养于室温22～25 ℃的环境下，并自由饮食、饮水适应性喂养1周后，进行后续实验，并于实验前12 h禁食、自由饮水2 方法2.1 分组、造模与给药取大鼠30只，采用随机数字表法随机分为5组，即正常对照组（A组）、致伤空白组（B组）、致伤腹腔注射治疗组（C组）和致伤低、高剂量雾化吸入治疗组（D、E组），每组6只按如下步骤制作烟雾吸入性肺损伤模型：提前在烟雾发生器内放入松木屑，打开电源，发烟15 min，打开致伤室进气口阀门和风扇，当报警器报警后关闭阀门;B、C、D、E组大鼠腹腔注射盐酸氯胺酮（100 mg/kg）进行麻醉后，放入致伤室下层，打开致伤室中间开槽式拉板，使大鼠吸入烟雾致伤5 min;关闭开槽式拉板，取出大鼠置于空气流通处5 min，当其呼吸和心率接近致伤前水平后再次同法致伤，共重复操作3次，整个致伤过程约持续30 minA组大鼠除不放松木屑外，其余步骤操作与上述致伤组别相同参考相关文献[8-10]，将D、E组大鼠的给药剂量分别设定为9、18 mg/kg;参考相关文献[9-10]，腹腔注射依达拉奉9 mg/kg效果明显且具有剂量依赖性，故C组选。
