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1、 葛根总黄酮对大强度耐力训练大鼠红细胞抗氧化能力和酶活性影响的实验研究 熊正英张怡李宝成摘要：目的：探讨葛根总黄酮对大强度耐力训练大鼠红细胞抗氧化能力及红细胞膜ATP酶（ATPase）活性影响的机理。方法：建立大强度耐力训练动物模型，测试大鼠红细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH睵x)、过氧化氢酶(CAT)活性，还原型谷胱甘肽含量（GSH）和丙二醛(MDA)含量。结果：灌服葛根总黄酮组大鼠力竭运动后红细胞SOD、GSH睵x、CAT酶活性和GSH含量较显著高于训练对照组（P0.05）；MDA的含量极显著低于训练对照组（P0.01）；红细胞膜ATPase活性较显著高于训练对照
2、组（P0.05）。结论：葛根总黄酮可以改善长时间大强度耐力运动中红细胞的氧化应激水平，保护膜上ATPase的活性，有利于运动中红细胞结构和功能的完整性，可作为耐力运动员的运动补剂进行深入的开发和利用。关键词：葛根总黄酮；耐力训练；红细胞；抗氧化能力：G804.7：A：1007-3612(2008)02-0193-03本实验就葛根总黄酮对大强度耐力训练大鼠红细胞产生的自由基清除效果和对红细胞膜ATPase活性的保护作用机制进行深入研究，旨在阐释葛根总黄酮保护运性红细胞损伤的机制，并为其应用提供理论依据和实验支持。1材料与方法1.1实验材料与对象实验材料为太白野葛根，通过冷浸法1提取葛根总黄酮，然
3、后用灭菌双蒸水配制成浓度为150 mg/mL的悬浮液。实验对象为SD雄性大鼠（由陕西中医研究所实验动物饲养中心提供）24只，体重180 g-220 g，两月龄，适应性饲养3 d并筛选出不能训练的异常大鼠。1.2实验方法将大鼠随机分为安静对照组（安静组）、大强度耐力训练组（训练组）和训练服药组（训练服药组）。按实验组分笼饲养，饲养室温度为25左右，湿度为(58.92177)%，照明随同自然变化。安静组安静饲养，自由饮食、摄水；训练组和训练服药组于动物跑台上先进行5周的适应性训练，然后进行2周大强度耐力训练。适应性训练期间每天训练20 min，每周5d，坡度为0，跑速每周递增，分别为15 m/mi
4、n，22 m/min，27 m/min，31 m/min和35 m/min，共5周；强化训练期间每天训练30 min，每周7 d，坡度为0，速度为35 m/min，共2周。训练的同时服药组大鼠每日早8:00用葛根总黄酮悬浮液灌胃，给药量以500 mg/kg体重计算，每天0.8 mL灌服一次，对照组大鼠灌服同样剂量的蒸馏水。1.3取材及样品制备1.3.1取材力竭运动后即刻，用20%乌拉坦（0.5 mL/kg体重）腹腔麻醉后，腹股静脉采5 mL抗凝全血。1.3.2样品制备红细胞的制备：取肝素抗凝全血1 5002 000 rpm/min 4离心5 min，除去血浆和灰白色的白细胞层，按1:2体积加入
5、生理盐水，混合后反复洗涤3次，离心条件同上，除去上清夜留压积红细胞。分离好的红细胞于-20冰箱冻存。红细胞膜样品制备：取上述沉淀的红细胞按1/10 (v/v)加入预冷的破膜液(0.1mmol/LEDTANa, 2.5 mmo1/L NaHPO4, 0.03 m mol/L PMSF, PH 7.4-8.0)，均匀搅拌2 min，待完全溶血后，以12 000 rpm/min 4离心10 min，将沉淀重复依上法再洗涤3次，弃去上清及离心管底部褐色的纤维状沉淀物，收集乳白色的红细胞膜样品，取50L用考马斯亮兰试剂做蛋白定量，将红细胞膜用低渗液（破膜液）配成蛋白含量为2 mg/mL左右的悬液，将上悬
6、液分装到小容器中，-20冰箱冻存。1.4测试指标及方法谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原型谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、ATPase（超微量分型）各测试指标均采用南京建成试剂盒进行测试，测试方法严格按照试剂盒说明书进行。1.5数据处理实验所得数据均采用SPSS12.0统计软件对所测数据进行组间双尾检验，实验数据均以平均数标准差(XSD) 来表示。2结果2.1葛根总黄酮对大强度耐力训练大鼠红细胞抗氧化能力的影响注：代表安静组与训练组比较，代表具有较显著性差异（P0.05），代表具有极显著性差异（P0.01）；#代表训练组与训练服药组比
7、较，#代表具有较显著性差异（P0.05），#代表具有极显著性差异（P0.01）。由表1结果显示，训练组大鼠在力竭运动后，红细胞抗氧化指标SOD、CAT、GSH-Px活性以及GSH含量极显著的低于安静组（P0.01），而红细胞MDA含量相对安静组有极显著的升高（P0.01）。训练服药组大鼠在力竭运动后，红细胞抗氧化指标SOD、CAT活性以及GSH含量较显著的高于训练组（P0.05），红细胞GSH-Px活性极显著的高于训练组（P0.01），红细胞MDA含量相对训练组有极显著的下降（P0.01）。训练服药组大鼠在力竭运动后，红细胞抗氧化酶的活性都低于安静组，而MDA的含量则显著的高于安静组水平。2.
8、2葛根总黄酮对大强度耐力训练大鼠红细胞膜ATPase活性的影响由表2可以看出，训练组大鼠在力竭运动后，红细胞膜ATPase（Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性极显著的低于安静组（P0.01）。训练服药组大鼠在力竭运动后，红细胞膜ATPase（Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性都较显著的高于训练组（P0.05），其中Na+,K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性都较显著的低于安静组（P0.05）。3讨论3.1葛根总黄酮对大强度耐力训练大鼠红细胞抗氧化能力的影响及其机制探讨3.1.1葛根总黄酮对大鼠
9、红细胞SOD活性和MDA含量的影响及其机制探讨本实验中训练组大鼠在力竭运动后红细胞SOD活性显著地下降。这样的结果提示，大强度的力竭性运动使训练大鼠红细胞内量快速大量的增多，SOD也随着被大量利用以催化的歧化反应，与此同时这一反应的产物H2O2也随运动而快速增加。H2O2可以破坏酶活性中心的金属配位场结构而引起酶失活2。红细胞MDA含量也明显升高，说明了红细胞内的自由基大量生成，致使自由基代谢失衡，红细胞内的氧化损伤加剧。训练服药组大鼠在力竭运动后，红细胞SOD活性显著高于训练组，而MDA含量显著低于训练组的水平。说明葛根总黄酮可以保护大强度耐力运动中红细胞内SOD的活性，降低红细胞内的氧化应
10、激水平。其机制可能与葛根总黄酮具有显著的抗氧化功能有关。葛根总黄酮属于多酚羟基化合物，可以通过酚羟基与自由基反应生成较稳定的半醌式自由基从而终止自由基链式反应；再者其相邻的羟基或羧基上的氧原子可以作为配位原子同金属离子配合形成螯合物，也可与某些高价金属离子如Fe3+等作用形成络合物，把金属离子从高价态还原至低价态3,4，从而保护长时间大强度运动中红细胞内Hb的氧化还原状态，有利于红细胞的携氧能力，提高大鼠的运动能力。3.1.2葛根总黄酮对大鼠红细胞CAT、GSH-Px活性和GSH含量的影响及其机制探讨在生理状况下，红细胞内H2O2主要由CAT和GSH-Px催化的反应来灭活。CAT可以直接将H2
11、O2分解为H2O和O2，但H2O2的大量堆积也可抑制CAT活性2。还原型GSH在GSH-Px作用下与过氧化物反应后成为氧化型GSSG，此氧化还原过程可以消耗过氧化物，降低过氧化物对细胞的损伤作用。大量研究表明，长时间大强的耐力运动可以使红细胞内GSH大量减少，GSH-Px活性下降，致使红细胞内的谷胱甘肽循环系统的代谢速度减慢，最终导致红细胞氧化损伤加剧5,6。有人研究表明，一次性长时间耐力运动训练，可使红细胞的GSH水平下降7,8；在极限负荷运动后即刻GSH下降30%。从表1可以看出，训练组大鼠在力竭运动后，红细胞抗氧化指标GSH、GSH-Px、CAT的值极显著的低于安静组。说明红细胞内H2O
12、2大量堆积，GSH消耗大于合成，致使其含量显著下降，从而影响了GSH-Px的活性，导致H2O2水平持续升高，红细胞氧化损伤加剧。训练服药组大鼠在力竭运动后，红细胞抗氧化指标GSH、GSH-Px、CAT的值都显著的高于训练组的水平。说明葛根总黄酮可以抑制大强度耐力运动造成的红细胞内H2O2的过度堆积。蒋风萍等9的实验表明，葛根总黄酮中的葛根素对体外黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶、H2O2和紫外线（UV）照射等三种自由基产生体系诱导细胞的脂质过氧化反应都有显著的抑制作用。朱庆磊等研究表明，葛根总黄酮能抑制H2O2引起的红细胞溶血反应，并可抑制LPO产生。葛根总黄酮可以提高大运动大鼠红细胞CAT、GSH-Px
13、活性和GSH含量，其机制可能与葛根总黄酮的多酚羟基化可以终止自由基链式反应，防止红细胞内H2O2大量堆积，进而保护了红细胞内抗氧化酶的活性，防止GSH的过度消耗，减轻了运动中红细胞的氧化应激水平有关。3.2葛根总黄酮对大强度耐力训练大鼠红细胞膜ATPase活性的影响及其机制探讨Na+,K+-ATPase是广泛存在真核细胞膜上的内在蛋白，Na+,K+-ATPase不对称地镶嵌在细胞膜内，是一个依赖于磷脂，需要磷脂来维持其活性的酶10。红细胞膜上的Na+,K+-ATPase的基本功能是将细胞内的Na+转移到细胞外，将细胞外的K+运送到细胞内，维持细胞内外的渗透压平衡和跨膜电位梯度。Ca2+-ATP
14、ase不仅对维持膜脂的不对称分布有主要作用，并维持细胞内Ca2+浓度，细胞内Ca2+升高可影响膜蛋白相互作用，降低红细胞膜粘弹性，并使红细胞膜脂质和膜骨架蛋白分离，使膜的稳定性和流动性降低，从而影响了细胞的正常功能11。Hespel等12研究表明，长期有氧运动的运动员，其静息状态红细胞膜内K+显著升高，而细胞内Na+、Mg2+含量及Na+,K+-ATPase活性无变化。另有研究发现13：力竭性运动可导致红细胞MDA含量升高、红细胞膜Na+,K+-ATPase活性显著降低，红细胞变形能力下降；而有训练的运动员，其细胞膜Na+,K+-ATPase活性在运动后显著升高。孙湄等14报道青少年进行次极限
15、强度运动后红细胞膜Ca2+-ATPase活性下降，ATP供应不足可能是酶活性下降的重要因素之一。表2结果显示，训练组大鼠在力竭运动后，红细胞膜Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性显著下降，说明长时间大强度耐力训练使大鼠红细胞的脂质过氧化程度加强。其机制可能是运动过程中产生了大量自由基，红细胞发生了脂质过氧化反应，抗氧化酶本身作为一种蛋白质也会受到自由基的攻击而活性下降。而训练服药组大鼠红细胞膜ATPase活性显著高于训练组，说明葛根总黄酮能显著提高红细胞膜Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase的活性，在一定程度上提高
16、了红细胞膜转运K+、Na+、Ca2+、Mg2+的能力。其机制可能与葛根总黄酮可以终止自由基链式反应，防止细胞膜上的不饱和脂肪酸以及膜内的脂质、蛋白质等的自由基损伤，进而保护了运动中红细胞膜上ATPase的活性，有利于维持运动中红细胞结构和功能的完整性。4小结1) 葛根总黄酮可以保护长时间大强度耐力运动中红细胞内抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）的活性，提高抗氧化物质GSH的含量，从而降低了脂质过产物MDA的生成，说明葛根总黄酮对大强度运动过程中红细胞内产生的过量自由基具有较强的清除作用，改善了运动中红细胞的氧化应激水平，这对保护运动中红细胞内Hb的氧化还原状态，保证红细胞的携氧能力。2) 葛根总黄酮可以保护长时间大强度耐力运动中红细胞膜Na+,K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-AT
