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1、 芽胞杆菌JK05的鉴定及其对香蕉、玉米的促生和生防潜能研究 郭立佳 汪军 杨腊英 梁昌聪 周游 刘磊 黄俊生摘 要：解淀粉芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌等是重要的有益微生物，被广泛应用于植物病虫的生物防治。前期分离获得1株芽胞杆菌JK05，对其形态、生理生化特征、16S rRNA和gyrA基因序列进行分析，将其鉴定为解淀粉芽胞杆菌植生亚种Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum。对峙培养实验结果显示，JK05菌株对多种植物病原镰刀菌具有拮抗作用。植物生长促进实验表明，JK05菌株对香蕉和玉米生长具有明显促进作用。盆栽实验结果显示，JK05
2、菌株对香蕉枯萎病具有良好的防治效果。采用特异引物对JK05菌株基因组DNA进行PCR扩增，其可扩增到表面活性素（surfactin）、丰原素（fengycin）、伊枯草菌素A（iturin A）等抗生素合成基因。综上，JK05菌株具有良好的生防潜力，有望应用于生物农药和微生物肥料。关键词：芽胞杆菌;拮抗;镰刀菌;促生长：S432.4 文獻标识码：AAbstract： Bacillus strains， including Bacillus amyloliquefaciens， B. subtilis and B. thuringiensis， are important beneficial
3、microbes， which have been applied for the biocontrol of plant diseases and pests. We isolated a Bacillus strain named JK05 previously， and it was identified as Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum based on its morphological characterization， physiological， and biochemical properties as well a
4、s 16S rRNA and gyrA gene seqences analysis. The confrontation assay showed that JK05 had antifungal activities against a number of fungal phytopathogens. Plant growth promotion assay revealed that JK05 played roles in promoting plant growth of maize （Zea mays L.） and banana （Musa spp.）. The pot assa
5、y demonstrated that JK05 possessed a prominent effect on the control of Fusarium wilt of banana caused by F. oxysporum f. sp. cubense. The PCR assay performed using the specific primers for genes related to the antibiotic biosynthesis revealed that the genome of JK05 contained the genes responsible
6、for the synthesis of surfactin， fengycin and iturin A. The results suggested that JK05 had an excellent biocontrol potential， which could be applied as biopesticides and biofertilizers.Keywords： Bacillus; antagonism; Fusarium; plant growth promotion芽胞杆菌（Bacillus spp.）普遍存在于自然环境中，大部分芽胞是非致病的，相反许多芽胞杆菌对人
7、类是有益的，可产生应用于不同领域的酶。解淀粉芽胞杆菌（B. amyloliquefaciens）是核糖核酸酶的来源，且产生的淀粉酶用于水解淀粉。枯草芽胞杆菌（B. subtilis）产生的蛋白酶subtilisin用于制备洗涤剂，产生的限制性内切酶BamH I用于DNA研究。另外，许多芽胞杆菌可产生抗生素、生长素（吲哚乙酸）、赤霉素等次生代谢物，其抗生素在医药和农业领域具有十分重要的应用价值1-5。但少数芽胞杆菌具有寄生致病性，常见寄生致病类的芽胞为：引起人类和动物炭疽病的炭疽杆菌（B. anthraci）、引起食物中毒的蜡样芽胞杆菌（B. cereus）、引起昆虫中毒的苏云金芽胞杆菌（B.
8、thuringiensis）以及引起植物细菌病害的禾草巨大芽胞杆菌（B. megaterium pv. cerealis）6和短小芽胞杆菌（B. pumilus）7 等。此外，许多枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌菌株具有抑制植物病原真菌生长，促进作物生长、诱导植物抗性等功能，被应用于生产生物肥料和生物农药1-2。应用其有益微生物被认为是实现作物合理、安全治理最有前景的措施之一。由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）引起的香蕉枯萎病是重要土传维管束病害。为探索香蕉枯萎病有效防治措施，国内外许多学者开展生防菌筛选和评价相关的研究。张妙宜等8从黄豆酱
9、中分离筛选得到香蕉枯萎病菌拮抗细菌，其中1株为解淀粉芽胞杆菌，其粗蛋白和乙醇提取物具有稳定的抑菌活性。陈川雁等9发现，接种低浓度的枯草芽胞杆菌R31能激发香蕉根系免疫反应和活性氧产生，并延长R31在根表定殖，最终影响其对枯萎病的防效。王国芬等10对收集的生防菌资源进行抗性筛选，筛选到的3株拮抗芽胞杆菌分别施用于土壤中，其均可降低香蕉枯萎病菌数量。盆栽实验显示，其中A5-6菌株的防治效果可达72.3%。张琳等11发现，枯草芽胞杆菌TR21可湿性粉剂能降低粉杂1号发病率，而在叶腋上增加接种该菌的栓剂（剂型）处理可显著增加单株产量，并显著缩短粉杂1号生育期。石妞妞等12研究枯草芽胞杆菌T122F菌株
10、在香蕉中的内生定殖及其对香蕉枯萎病的生防效果，盆栽实验结果显示，其防治效果达66.0%。Yuan等13发现，施用含有解淀粉芽胞杆菌NJN-6的生物菌肥可抑制香蕉枯萎病，并促进香蕉的生长。类似地，Zhang等14研究发现，施用枯草芽胞杆菌N11的生物菌肥可有效控制香蕉枯萎病的发生。Wang等15从健康香蕉根际分离获得一些枯萎病菌拮抗菌，其中包括解淀粉芽胞杆菌W19，将其与有机肥混合施用可显著降低香蕉枯萎病的发生，并促进香蕉的生长。同时W19可产生3种脂肽物质包括伊枯草菌素（iturin A）、杆菌霉素bacillomycin D和表面活性素surfactin，以及18种挥发性的真菌拮抗物质。可见
11、，国内外学者对香蕉枯萎病的生物防治开展了大量研究，然而对分离菌株的拮抗和促生长的机理研究相对比较薄弱。本研究作者所在的研究室对芽胞杆菌进行了大量分离筛选，获得一些对多种病原镰刀菌具有拮抗作用的芽胞杆菌菌株。其中1株芽胞杆菌生长繁殖迅速，对香蕉枯萎病菌具有较强的拮抗作用，对该菌株进行鉴定，并分析生防应用潜能以及拮抗和促生长的机理，以期用于枯萎病的防治和生产生物肥料。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试菌株 JK05是从香蕉根际土壤中分离纯化获得的细菌菌株。供试10株真菌菌株（FG01-FG10）为本课题组保存的菌株。供试香蕉品种为巴西蕉（Musa spp. AAB cv. Brazil），
12、玉米品种为京香糯2000（Zea mays L. cv. Jingxian?g?nuo 2000）。盆栽基质为椰糠与营养土混合物（体积比73）。1.1.2 培养基 供试细菌菌株JK05所用的培养基为LB培养基。供试真菌的培养与拮抗谱测定采用PDA培养基。IAA检测培养基（胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化鈉5g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、葡萄糖2.5g/L、色氨酸 100 mg/L，最终pH （7.30.2）。1.2 方法1.2.1 细菌基因组DNA提取 将细菌JK05接种于装有LB培养液的三角瓶中，置于摇床中于37、150r/min条件下过夜培养，取1mL培养物，10000r/
13、min离心收集菌体，采用上海生工生物工程有限公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（B518225）所提供的方法提取细菌基因组DNA。1.2.2 细菌菌株JK05的鉴定 用接种环取少量菌液划线培养于LB平板上，37过夜培养后，观察菌落形态，同时进行革兰氏染色，芽胞染色，在1000显微镜下观察细菌细胞和芽胞形态。V-P实验、甲基红（MR）实验、明胶和淀粉水解、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、生长温度、pH、耐盐、溶菌酶抗性以及碳氮源利用等实验，参照常见细菌系统鉴定手册16和伯杰氏细菌鉴定手册17所列的相应方法进行。16S rRNA的PCR扩增扩增是采用通用扩增引物（27F： 5-AGAGTTT?GA?T
14、C?CT?GGCTCAG-3和1492R： 5-TGACTGAC?TG?A?G?G?YTACCTTGTTACGACTT-3），以基因组DNA为模板，PCR扩增程序和反应体系按照Amann等18的方法进行，预计扩增约1500 bp的DNA片断。gyrA基因的扩增采用Chun等19报道的引物（p-gyrA-f： 5-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCT T-3和p-gyrA-r：5-CAAGGTA?A?T?G-CTCCAGGC ATTGCT-3），反应体系和扩增条件与扩增16S rRNA相同，预计扩增1025 bp的DNA片断。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程（上海）
15、股份有限公司测序。测序结果与9株其他模式菌株的16S rRNA和gyrA基因序列利用MEGA 5.2软件进行多序列比对，并采用邻接法（自展1000次）构建系统发育树。1.2.3 JK05菌株拮抗植物病原镰刀菌的测定 将11种病原镰刀菌（表1）分别在PDA平板上培养5d，沿菌落边缘打菌饼（直径约7mm），各取1块接种于PDA平板上，距离平板中心2cm左右，将细菌菌株JK05划线（长约4cm）接种于镰刀菌菌饼的另一侧，使两者之间的距离大约为3cm。对照用无菌水代替菌液划线，每个镰刀菌菌株重复3次。PDA平板于28培养5 d后，测量镰刀菌菌落半径。抑制率的测定采用公式：抑制率=（对照菌落半径?拮抗菌
16、落半径）/对照菌落半径100%。1.2.4 JK05发酵滤液对病原镰刀菌的测定 JK05菌株采用28、150r/min振荡培养48h后，10000 r/min离心5min收集上清液，并用滤器（孔径0.22?m）过滤制备成无菌滤液。测定方法，在距离菌饼边缘约3cm处放置大小约4cm0.5cm的灭菌滤纸片并分别加100?L无菌滤液代替菌液划线，无菌水为对照，每个菌株重复3次。28培养5d，然后测量菌落半径，计算抑制率。1.2.5 盆栽实验测定JK05菌株对香蕉枯萎病的防控效果 JK05菌株在LB培养液振荡培养48h后，稀释10倍，取20mL稀释液浇灌于香蕉幼苗（株高约10cm）的根际，对照用稀释相同倍数的LB培养液替代。每组共处理20株，共重复3次。在施用JK05菌株2 d
