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1、 脱氧核酶纳米材料复合物用于生物传感研究进展 赵旭华+孟红敏+龚亮+邱丽萍+张晓兵+谭蔚泓摘 要 脱氧核酶（DNAzyme或DNA酶）是一类具有高效催化活性和特异性识别功能的DNA分子，可以通过体外筛选方式从随机脱氧核苷酸单链库中获得，它具有催化效率高、特异性高、稳定性好、合成简单且修饰方便等优点。脱氧核酶与纳米材料的结合， 既保留了脱氧核酶的催化特性和识别能力， 又引入了纳米材料的信号转导功能，实现了识别与信号转导功能的一体化，大大促进了生物传感器的快速发展。本文主要介绍了金纳米颗粒、石墨烯、量子点、磁性纳米颗粒等纳米材料结合脱氧核酶用于生物传感的研究进展。关键词 脱氧核酶； 纳米材料； 生
2、物传感器； 评述1 引 言纳米材料是由粒径小于100 nm的超细颗粒构成的零维、一维、二维、三维材料的总称。由于纳米材料具有独特的尺寸结构，所以有着传统材料不具备的一些特征1：（1）表面效应 指随着微粒粒径的变小， 其表面原子数与总原子数之比急剧增大， 从而引起纳米微粒性质的变化。由于这些纳米微粒表面原子处于严重的缺位状态， 使得它易与其它原子结合， 达到稳定状态，故具有很高的化学活性。（2）小尺寸效应 指由于纳米颗粒的尺寸变小所引起的光、力、热、电、磁等宏观物理性质的变化。如纳米颗粒的熔点远低于块状金属的熔点； 当金属纳米颗粒的直径小于10 nm时，就会失去原有的金属光泽，呈现出黑色。（3）
3、量子尺寸效应 指当颗粒的尺寸下降到纳米级时，费密能级附近的电子能级就会由准连续态变为分立能级，能级间的间距随颗粒尺寸的减小而增大。当热能、磁场能或电场能比平均的能级间距还小时，纳米微粒就会呈显出一些与宏观物体截然不同的特性，如由导电的金属制备的纳米颗粒可以变为绝缘体。（4）宏观量子隧道效应 是指微观粒子贯穿势垒的能力。纳米材料的这些特征使其表现出一系列独特的光学、电学、力学、磁学以及催化性能2，3。目前， 纳米材料已经被广泛应用于信息工程、能量储存、生物传感、分子器件及选择性催化等研究领域， 并逐渐成为科研人员关注的焦点47。脱氧核酶（DNAzyme或DNA酶）是一类具有高效催化活性和特异性识
4、别功能的DNA分子，可以通过体外筛选方式从随机脱氧核苷酸单链库中获得812。脱氧核酶可以催化DNA或RNA切割、DNA水解以及DNA连接等多类反应7，1215，但常见的脱氧核酶主要包括RNA切割型脱氧核酶与G四聚体脱氧核酶两大类。与传统蛋白酶相比，脱氧核酶具有以下优点： 首先，它的稳定性高，在较高温度下其活性不受影响；其次，脱氧核酶的相对分子量比较小且具有很高的催化效率； 此外，脱氧核酶的合成简单、修饰方便并且受酸度等环境因素影响比较小。脱氧核酶的上述优点使其受到了越来越多研究者的关注，并且已被广泛应用于多个研究领域1620。如脱氧核酶可以作为一种工具酶，用于细胞水平上的基因敲除，即特异性地使
5、某一基因失活， 然后观察该基因在细胞生理、生化中的作用，研究该基因的功能，以便用于抗病毒、抗肿瘤的基因治疗19，20。由于具有高效催化活性和对辅因子依赖性的特异性识别功能，脱氧核酶也可用于生物传感器的构建2123，但如何将脱氧核酶与目标物的识别信息转化为可检测的物理信号，一直是生物传感研究领域的难点和热点。脱氧核酶与纳米材料的结合既保留了脱氧核酶的催化特性和识别能力， 又引入了纳米材料的信号转导功能，实现了识别和信号转导功能的一体化，有利于设计出高灵敏度、高选择性及高效的生物传感体系，从而为分析化学和材料科学的发展提供了新动力。基于上述优点，脱氧核酶已与石墨烯、纳米金、量子点和磁性纳米颗粒等纳
6、米材料广泛结合，发展了一系列新型生物传感器。本文将围绕各种新型纳米材料在脱氧核酶生物传感器中的应用进行评述。2 脱氧核酶-纳米金复合物在生物传感中的应用纳米金颗粒（Gold nanoparticles， AuNPs）又称胶体金或金溶胶，具有大的比表面积、高催化活性以及尺寸依赖的光学性质等独特的物理化学性质24。纳米金颗粒的制备技术与表面修饰技术的发展提高了它的稳定性、水溶性和生物相容性，拓宽了其在生物分子标记和检测、纳米生物传感器以及纳米生物芯片等方面的应用2527。2.1 基于脱氧核酶-纳米金颗粒的比色型传感器的研究纳米金颗粒是在比色传感器中常用的一种信号探针，其表面等离子体效应与自身粒径的
7、大小以及颗粒之间的距离有关。当纳米金颗粒由分散状态变为团聚状态时，其颜色会由红色变为蓝色或紫色。基于上述原理， 科研工作者发展了一系列比色型的脱氧核酶传感器2833。Lu研究组29首次将DNAzyme通过SAu键共价修饰于纳米金表面构建了一种可用于检测Pb2+的比色传感器。如图1A所示，底物链的两端延长， 便于与金纳米颗粒表面修饰的DNA以头对尾的方式杂交。当不存在Pb2+时，底物链与酶链以及纳米金表面修饰的DNA之间形成稳定杂交，纳米金颗粒团聚，溶液显示蓝色。当加入Pb2+后，底物链被切断， 抑制了纳米金的团聚，溶液显红色。该传感器的检出限为100 nmol/L，可用于油漆中Pb2+的检测。
8、然而该传感器采用头对尾的杂交方式会产生很大的空间位阻，因此需要复杂的加热-冷却过程。为了解决这个问题，该小组又采用了尾对尾的杂交方式， 降低了杂交产生的空间位阻， 并使反应可以在室温下进行30（图1B）。此外，他们又引入了一段可与切割后的底物链片段杂交的DNA序列， 用于促进纳米金的释放，使得传感器的响应时间只需5 min30。由于上述DNA酶传感器都需要将DNAzyme共价修饰在纳米金表面，过程复杂、成本较高， 且耗时长，因此该小组又基于DNA酶切割底物链可产生单链DNA，而单链DNA能保护纳米金颗粒在较高盐离子条件下不会团聚，设计了一种非标记的比色传感器用于Pb2+和UO2+2的检测32（
9、图1C）。与此同时，Wang研究组33也报道了类似的无标记检测Pb2+的比色型DNA酶传感器。除此之外，Lu研究组34还基于脱氧核酶的催化连接活性， 设计了一种比色型传感器， 用于Cu2+的检测，该传感器的背景干扰小，灵敏度高。上述结果表明，标记型传感器需要较长时间进行预处理和制备，但是当制备好传感器后更易endprint图1 DNA酶比色传感器设计原理图（A） 纳米金以“头对尾”的方式连接29；（B）纳米金以“尾对尾”的方式连接30；（C）非标记策略用于引发纳米金的团聚32Fig.1 Schematic illustration of the DNAzyme based colormetri
10、c sensors. （A） Gold nanoparticles were aligned in a “head-to-tail” manner29； （B） Gold nanoparticles were aligned in a “tail-to-tail” manner30； （C） Label-free strategies of recognition-triggered aggregation state change of gold nanoparticles 32于操作和检测；而非标记型传感器的灵敏度更高，且无需长时间制备、更加经济，然而在检测过程中易受到离子强度及其它一些因
11、素的影响。2.2 基于脱氧核酶-纳米金颗粒的荧光传感器的研究纳米金颗粒除了可以作为信号报告基团用于比色分析外，还可用于荧光检测。人们利用纳米金颗粒作为荧光猝灭剂， 发展了一系列DNA酶荧光传感器3538。Wang等35设计了一条底物链与酶链一体化的探针，并将该探针通过SAu键共图2 A 基于纳米金作荧光猝灭剂的DNAzyme荧光传感器36； B 基于荧光偏振技术的DNA酶生物传感器原理示意图38Fig.2 （A） Schematic illustration of DNAzyme-based fluorescent biosensors using gold nanoparticles as
12、fluorescence superquencher36 and （B） Schematic illustration of DNAzyme-based fluorescence anisotropy assay38价修饰于纳米金颗粒表面。由于标记在底物链末端的荧光团会靠近纳米金，故荧光被猝灭。当加入Pb2+后， 底物链被切断，标记有荧光团的部分底物片段游离出来，荧光得以恢复，从而实现了Pb2+的定量检测（图2A）。此外，Malashikhina等36发展了一种DNA酶与纳米金结合的荧光生物传感器， 用于抗坏血酸的检测。Yin等37基于荧光偏振的方法设计了一种可以检测金属离子的DNA酶传感器（
13、图2B）。标记有荧光团的底物链与共价修饰在纳米金上的酶链杂交，由于大分子在溶液中运动慢，故荧光各向异性值大。Pb2+存在时， 底物链被切割，标有荧光团的部分底物片段与纳米金分离，导致荧光各向异性值变小。然而， 上述传感器都仅限于体外生物分子的检测，构建可高灵敏和特异性检测体内生物分子的脱氧核酶生物传感器已成为近年来研究的热点。Lu课题组基于金纳米颗粒高的荧光猝灭率构建了一种可检测细胞内UO2+2的生物传感器38。DNA酶链共价修饰于纳米金表面，底物链两端分别标记有Cy3荧光团和BHQ猝灭团。当酶链与底物链杂交后，由于双重猝灭作用，Cy3的荧光被有效猝灭。当加入UO2+2后，UO2+2催化底物链
14、的RNA水解，从而使标记有荧光团的部分底物片段游离出来，荧光得到恢复。该荧光纳米探针经内吞作用进入细胞后，可以实现活细胞内UO2+2的成像检测。2.3 纳米金颗粒作为信号放大基团在生物分析中的应用传统的检测方法中，探针的一端只能标记一个生物分子，其灵敏度受到限制。而纳米金具有比较大的比表面积，作为探针载体其表面可标记多个生物分子，从而可以实现检测信号的放大3942。图3 基于树枝状纳米结构引发的放大传感策略用于Pb2+检测原理示意图40Fig.3 Schematic of the amplified sensing strategy of DNA-Au dendrimer-based SERS
15、 biosensor for Pb2+ detection40本研究组发展了一种基于树枝状纳米结构信号放大技术的新型SERS传感器39（图3）。其底物链和酶链通过10个聚T碱基连接在一起，且底物链的末端标记有巯基，可通过SAu键组装在金电极表面。当加入Pb2+后，底物链中RNA碱基被水解，使其被切割为两部分，与酶链连接的部分底物序列从金电极表面脱落下来，而金电极表面剩余的底物片段可与纳米金标记的报告探针杂交，然后通过层层自组装形成树枝状纳米结构，SERS信号得到显著增强，从而实现Pb2+的高灵敏检测。而Shen等40构建了一种以DNA功能化纳米金作为信号放大基团的DNA酶电化学传感器。标记有巯
16、基的DNA酶链首先被组装在金电极表面，而报告DNA 探针标记在纳米金颗粒表面，底物链则分别与酶链和报告DNA探针杂交形成三明治结构。由于电活性物质六氨合钌可以嵌入报告DNA 探针中从而获得较大的电流信号。Pb2+的加入使得底物链被切断，导致标记有报告DNA 探针的纳米金颗粒从电极表面脱离，导致电化学信号减小，由此可以放大检测Pb2+，与不用纳米金放大基团相比，其灵敏度提高了5倍。3 脱氧核酶-石墨烯复合物在生物传感中的应用石墨烯（Graphene）是一种由碳原子通过sp2杂化构成的单层蜂窝状的平面薄膜，它可以折叠成零维的富勒烯，卷曲成一维的碳纳米管或堆垛形成三维的石墨，因此石墨烯是构成其它碳质材料的基本结构单元43。石墨烯具有比表面积大、机械强度高、导电性和导热
