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1、 蜂蜜中氯霉素分析方法的研究概况及展望 余志清摘 要：氯霉素作为违禁药品，其残留物在蜂蜜中的检出显示出不良商家在养殖过程中存在不同程度的滥用。为了能对其残留量准确分析，从而将此类情况严格控制在源头，国内外都有不同的分析方法。本文主要对目前运用较多的酶联免疫法、气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、中性解吸-电喷雾萃取电离质谱法、分子印迹法、胶体金免疫层析法、电化学法进行概述，并分析不同方法的优缺点，从而对蜂蜜中氯霉素残留量的检测方法进行展望。关键词：氯霉素；蜂蜜；分析方法：S896.1 ：A ：1671-2064（2018）13-0224-02中国是蜂蜜生产及出口
2、大国，据统计，我国蜂蜜2017年11月份出口量约为1100万千克，出口金额约为2300万美元。欧盟是世界上重要的蜂蜜进口地区，而我国是蜂蜜出口的主要市场之一，自2006年来欧盟食品和饲料预警系统RAAFF中有关从中国进口蜂蜜的通报有31例，其中90%以上是由抗生素残留超标引起的1。我国目前已出台相应标准对蜂蜜中氯霉素的残留进行限定，其中农业部第235号公告明确规定氯霉素为禁用药物。氯霉素（Chloramphenicol，CAP）又称氯胺苯醇或做霉素。主要成分是由委内瑞拉链霉菌产生的代谢物，商业制剂为白色针状或微带黄绿色的针状、长片状结晶或结晶性粉末，味苦。长期使用可引起视神经炎、共济失调以及由
3、于菌群失调而致的微生物素缺乏等不良反应。儿童应用本品，可引起循环衰竭、贫血、出血倾向和反复感染，甚至诱发再生障碍性贫血2。而养蜂过程中滥用氯霉素预防或治疗蜂蜜疾病是我国蜂蜜氯霉素含量超标的主要原因，且其残留对蜂蜜品质的影响是长期的。因此，通过进一步加强“从养蜂到餐桌”全程的兽药残留监控，才能保证我国蜂蜜的品质，从而减少对我国蜂蜜出口的影响。从目前我国蜂蜜中氯霉素残留量检测方法的现状来看，主要分为酶联免疫法、气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法，同时包括中性解吸-电喷雾萃取电离质谱法、分子印迹法、胶体金免疫层析法、电化学法。1 酶联免疫法目前，现行有效的国家标准中有
4、2个酶联免疫法针对蜂蜜中氯霉素的检测，均基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定，且在450nm处测定吸光度，根据吸光度值得出样品中氯霉素的残留量。同时，刘姚等3以抗氯霉素单克隆抗体为包被原，氯霉素-辣根过氧化物偶联物为标记物，TMB作显色底物，对标准品稀释液、包被温度、包被抗体稀释倍数等六个因素进行优化，建立了曲线方程式为y=-17.425x+97.509的直接競争ELISA标准曲线，相关系数为R2=0.9913，且蜂蜜样品的检测限和定量限分别为0.15ng/g和0.33ng/g，添加回收率在97.58%100.94%之间，批内变异系数和批间变异系数均小于11%；另外整个检测反应过程耗时约为40m
5、in。表明该方法具有高精确度高稳定性。2 气相气质法由于氯霉素均含有电子亲和性强的化学基团，这使得利用气相色谱-电子俘获检测法对蜂蜜中的氯霉素进行检测成为可能。目前常用的气质检测方法通常采用GB/T 18932.20 -2003和农业部781号公告-10-2006，均采用水溶解蜂蜜试样，并用乙酸乙酯提取，将提取液浓缩后再用水溶解，经固相萃取柱净化、洗脱、氮吹后，用气相色谱质谱联用仪进行测定，外标法进行定量。3 液相液质法液相色谱及液相色谱质谱联用仪是目前检测蜂蜜中氯霉素较为成熟且回收率基质干扰较少的一种快速检测方法。吴华等4建立了高效液相色谱检测蜂蜜中氯霉素残留的方法。样品先用NaOH进行碱化
6、，经高速离心沉淀大部份有机酸、极性杂质，再用乙酸乙酯提取氯霉素。提取物在流动相甲醇0.2%磷酸氢二铵缓冲液=4060的条件下，在波长278nm处测定氯霉素。该方法最低检出浓度为0.01g/g，在0.110g/mL范围内，线性方程为y=60.404x+2.5945，相关系数R2=0.9993。加样回收率为82.9%86.7%，RSD为5.1%6.0%。冯雷等5则研究一种针对蜂蜜中氯霉素残留量的液质联用分析方法。采用水溶解蜂蜜，用乙酸乙酯萃取蜂蜜水溶液中的氯霉素，氮吹至干后用水溶解样品残渣，然后用HLB小柱进行固相萃取，对样品中的氯霉素进行净化前处理。以乙腈-水作为流动相，C18色谱柱对蜂蜜的氯霉
7、素进行分离，然后用电喷雾质谱负离子多反应监测模式对氯霉素进行检测，缩短了色谱分离时间，提高了检测灵敏度和分析结果可靠性，具有准确、快速以及高灵敏度和高选择性的特点，能够适应大规模样品的快速分析要求。胡晓慧等6采用高效液相色谱-串联质谱联用技术建立快速痕量检测蜂蜜中氯霉素的方法。该方法以氘代氯霉素（D5-氯霉素）为内标，在超声波辅助下，样品用乙酸乙酯进行碱性提取、净化后，以乙腈-水为流动相，并在电喷雾离子源负离子模式下进行多反应监测，实现对氯霉素的定性、定量分析，分析时间为8min。在检测范围为0.120g/mL内呈良好的线性关系，相关系数大于0.9990。当添加水平分别为0.20、0.50、5
8、.0g时，氯霉素的加标回收率为84.0%104.2%，相对标准偏差为1.95%5.04%。方法检出限为0.013g/kg，定量限为0.025g/kg。从而建立的方法快速高效，样品前处理简单，选择性好，灵敏度高，适用于蜂蜜中氯霉素残留的痕量检测。4 中性解吸-电喷雾萃取电离质谱法中性解吸-电喷雾萃取电离质谱技术是利用斜对放置的进气管和样品管提取和净化待测样品，再将样品流引入电喷雾萃取电离源，带电液与样品液滴进行碰撞融合，发生液液萃取和电荷转移进而达到去溶剂的效果，最终对待测物进行质谱分析7。刘星星等8利用自行研制的中性解吸-电喷雾萃取电离质谱技术建立了在无需样品预处理的条件下，对蜂蜜中氯霉素快速
9、直接检测的方法。通过张茜等9对实验条件的优化，采用了用硝酸银溶液（10mg/mL）为萃取剂，甲醇为中性解吸喷雾试剂，电喷雾萃取剂的流速为5g/min，电喷雾电压为4.5kV，离子源雾化气的压力为1MPa，离子源离子传输管的温度为250，解吸气所带甲醇喷雾的流速为14g/min的条件下，得到检测蜂蜜中氯霉素的更佳方法。5 分子印迹法分子印迹技术是指当模板分子（印迹分子或待测物）与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特型7。基于分子印迹技术，陈
10、海燕等10采用微波辅助法快速制备以氯霉素为模板分子的分子印迹聚合物。将合成的聚合物作为吸附剂，选择性分离和富集蜂蜜样品中的氯霉素，并结合高效液相色谱-串联质谱法对萃取物进行分析。对合成的分子印迹聚合物进行了表征，考察了聚合物的吸附性能及其选择性，并进行了Scatchard分析。结果表明，合成的聚合物为球形，对氯霉素具有良好的识别能力，最大表观结合量可达0.428mmol/g。该方法的线性范围为0.5100ng/g，相关系数0.999，蜂蜜中氯霉素的检出限为0.13ng/g，6种蜂蜜样品中氯霉素的加标回收率范围为88%93%。得到了一种低检出限、高回收率的快速分析方法。6 胶体金免疫层析法王元凤
11、等11通过肉眼观测试纸条显色情况、金标图像分析和ELISA试剂盒检测回收率，并结合试剂条自身特性采用了回收率最高的处理方法对蜂蜜中氯霉素残留检测，即称取4g试样于15ml离心管中，加入2ml蒸馏水振荡充分溶解。加入8ml乙酸乙酯，上下翻转振荡8min，静置至上层有机相澄清，转移5ml上层有机溶剂于5ml刻度冷冻管中，电吹风吹干。加入160lPBST缓冲液，溶解试管壁残留，再加入1ml正己烷充分振荡后静置分层，吸取下层水相进行待检。结果表明，该分析方法具有选择性好、灵敏度高的特点。7 电化学法张其美等12针对氯霉素建立了2种电化学检测方法，并将其应用于实际样品检测中，主要内容如下：（1）通过多巴
12、胺的自聚在玻碳电极表面修饰一层聚多巴胺膜，进一步通过过氧化处理制得过氧化聚多巴胺膜修饰电极，并采用方波伏安法对蜂蜜中的氯霉素残留进行了测定。结果表明，玻碳电极在2mg/mL多巴胺溶液中自聚2.5h，并在0.5mol/L的NaOH溶液中过氧化处理后得到聚多巴胺膜修饰电极，在氯霉素溶液中采用SWV阴极扫描时具有最佳的出峰效果。峰电流与氯霉素的浓度3.010-61.110-3mol/L范围内呈现良好的线性关系，检出限为7.810-7mol/L。该修饰电极制备方法简便易行、成本低、便于批量制备，用于检测氯霉素操作简单、选择性好，适用于蜂蜜等食品样品中氯霉素残留的测定。（2）以氯霉素为模板分子，邻苯二胺
13、为功能单体，采用电化学聚合法在铂微电极表面形成聚邻苯二胺膜，经洗脱液将模板分子洗脱，制得氯霉素分子印迹传感器，并用于快速和选择性检测蜂蜜样品中的氯霉素。该传感器的响应值与氯霉素的浓度在9.010-101.010-8mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为3.910-10mol/L。运用建立的方法对市售蜂蜜中的氯霉素进行测定，并用液相色谱-质谱联用技术进行了方法验证。结果表明，该传感器具有良好的选择性和较高的灵敏度，便于实现现场检测和分析，具有很好的应用前景。8 综述与展望以上所述的氯霉素残留物检测方法中，酶联免疫法具有方便、快速、易携带的优点，适合氯霉素残留物的初步筛选，较易出现假阳性的特点
14、。近年来，液相色谱-三重四级杆质谱联用仪越来越多应用于蜂蜜中氯霉素的检测，具有高效、灵敏、准确的优点，但由于其仪器价格不菲，一直未大范围使用。而分子印迹、电化学方法的兴起，必将有力推进现场执法的快速检测，对政府部门的监督起到一定的推动作用，从而从源头上控制住氯霉素的使用情况。参考文献1陳炯，李玉伟，宁准梅，贾英杰.欧盟蜂蜜抗生素残留监控体系研究及对我国的启示J.食品工业科技，2013，34（15）：277-280+319.2张炫，周丹银，郭艳红，赵凤云，和绍禹.蜂蜜中氯霉素残留来源与变化研究J.蜜蜂杂志，2013，33（02）：7-10.3刘姚，韦倩妮，王弘，杨金易，孙远明，徐振林，沈兴，李向
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