《獭兔酪氨酸酶相关蛋白1（Tyrp1）基因序列分析及外显子多态性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《獭兔酪氨酸酶相关蛋白1（Tyrp1）基因序列分析及外显子多态性研究（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 獭兔酪氨酸酶相关蛋白1（Tyrp1）基因序列分析及外显子多态性研究 郝晔 施丽娟 闫晓荣 赵博昊 朱杰 陈阳 翁巧琴 吴信生摘要目的探索獭兔酪氨酸相关蛋白1（Tyrp1）基因在毛色形成过程中的分子机制。方法对獭兔Tyrp1基因序列的核苷酸序列、编码产物的基本理化性质等进行预测和分析，同时利用PCRSSCP（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products）技术检测Tyrp1基因CDS序列的多态性分布状况。结果信息学分析发现，TYRP1蛋白是不稳定的亲水性蛋白，有信号肽，
2、具有酪氨酸酶家族特征性功能结构域。多态性检测发现仅在Tyrp1基因CDS的483 bp处存在1个CT的同义突变，位于外显子2上，该碱基的突变没有造成氨基酸的改变（AUCAUT，异亮氨酸）。HardyWeinberg 平衡检验表明，青紫蓝色獭兔群体处于非平衡状态，白色獭兔群体处于平衡状态。青紫蓝兔群体为中度多态信息含量（0.25pic0.50），白色獭兔群体为低度多态信息含量（pic关键词 獭兔；Tyrp1；SNPs；序列分析S829.1 A 0517-6611（2016）09-164-04Abstract Objective To discuss the molecular mechanism
3、 of tyrosinaserelated protein 1 （Tyrp1） gene of Rex rabbit （Oryctolagus cuniculus） during the formation of hair color. Method The Tyrp1 gene sequence， the nucleotide sequence， and the basic physical and chemical properties of coding products were forecasted and analyzed. At the same time， PCRSSCP（si
4、nglestrand conformational polymorphism）was used to detect the distribution of CDS sequences of Tyrp1. Result Bioinformatics analysis found out that Tyrp1 protein was an unstable hydrophilic protein， which had a signal peptide and a functional domain of the tyrosinase family. The polymorphism detecti
5、on result indicated that the exon 2 of Tyrp1 in 29 bp （the gene CDS 483 bp） had a CT mutation， and the nucleotide mutation did not lead to the amino acid change （AUCAUT， isoleucine）. HardyWeinberg equilibrium test showed that the Chinchilla Rex rabbit population was at HardyWeinberg disequilibrium，
6、the white Rex rabbit population was at HardyWeinberg equilibrium. PIC of chinchilla Rex rabbit population was of medium polymorphism （0.25 PIC 0.50）， white Rex rabbit population was of low polymorphism （PIC 0.25）. Conclusion Tyrp gene has certain effects on the hair color of Rex rabbit. This researc
7、h provides certain references for the selection of hair color of Rex rabbit.Key words Rex rabbit； Tyrp1； SNPs； Sequence analysisTyrp1基因是第1個克隆成功的色素基因，由于该基因编码的蛋白与酪氨酸酶同源，因此被称为酪氨酸酶相关蛋白1（Tyrosinaserelated protein1，TYRP1）1。很多学者提出了黑色素生物合成的三酶理论，即酪氨酸酶、多巴色素互变酶和5，6二羟基吲哚羧酸氧化酶，它们对黑色素的形成都有十分重要的作用，其中Tyrp1基因编码的5，6二
8、羟基吲哚羧酸氧化酶是酪氨酸酶重要的协同因子，与酪氨酸（Tyrosine，TYR）、酪氨酸酶相关蛋白2（Tyrosinaserelated protein2，TYRP2）一起组成酪氨酸酶相关蛋白家族2。也有研究表明，Tyrp1基因除了直接参与黑色素的生成反应外，还可能帮助稳定并调节酪氨酸酶的催化活性，参与维持黑色素小体的结构，并影响着黑色素细胞的增殖和凋亡3-4。笔者通过PCR技术扩增Tyrp1基因7个外显子的序列，对Tyrp1基因氨基酸序列进行了生物学信息分析，并利用PCR-SSCP技术和直接测序的方法对每个外显子进行多态性检测，分析Tyrp1基因在不同颜色獭兔（Oryctolagus cun
9、iculus）群体的多态性，探索其与獭兔毛色形成的关系，旨在为獭兔毛色的选种选育提供一定的参考。/pic0.50），白色獭兔群体为低度多态信息含量（pic1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验动物。随机抽取同批出生、健康的6月龄青紫蓝色獭兔392只、白色獭兔174只，共566只獭兔作为试验对象，试验个体均来自浙江省余姚市欣农兔业有限公司。1.1.2 试剂。蛋白酶K、10 TBE、Tris、EDTA、丙烯酰胺等试剂均购自生物（上海）工程有限公司；10%过硫酸铵、TEMED、SDS、甘油、甲醛等试剂均购自北京鼎国生物技術有限责任公司。1.1.3 引物设计。根据NCBI网站上公布的兔Tyrp
10、1基因全序列（登录号：NC_013669.1），分别在7个外显子区域外的邻近内含子区域设计并合成特异性较好的引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息见表1。1.1.4 Tyrp1基因序列分析软件。利用ExPASy工具对基因编码的蛋白质性质进行分析，利用ProtParam分析蛋白的氨基酸序列组成、相对分子质量和等电点等理化性质，利用网上在线工具SMART（http：/smart.emblheidelberg.de/），分析TYRP1蛋白结构域，并使用 NPS服务器上的SCOPMA分析预测蛋白的二级结构。利用TMPRED（http/www.ch.embnet.org/software
11、/TMPRED_form.html）进行蛋白质序列的跨膜区分析；运用ProtScale（http：/web.expasy.org/protscale/）进行氨基酸序列的亲水性分析。利用SwissModel（http：/swissmodel.expasy.org/）对TYRP1编码蛋白进行高级结构预测。1.2 试验方法1.2.1 DNA提取。采用传统酚/氯仿抽提法提取獭兔耳组织样基因组DNA，使用TE稀释到100 ng/L，使用NanoDrop ND1000核酸浓度测定仪测定DNA浓度，一般OD值的范围为1.71.9，峰图平滑的样品可用。1.2.2 PCR扩增。PCR反应体系（20 L）为：10
12、PCR Buffer 2 L、10 mmol/L dNTPs 2 L、10 pmol/L上、下游引物各1 L、5 U/L Taq酶0.2 L、100 ng/L DNA 模板1 L、ddH2O 12.8 L。PCR反应条件如下：95 预变性5 min；95 变性30 s，适宜的温度退火30 s，72 延伸30 s，35个循环；72 最终延伸10 min，10 下保存。1.2.3 PCRSSCP检测。在20 L PCR扩增产物中加入5 L上样缓冲液，混合体系在98 变性10 min后，置于-20 冰箱中冷却5 min，于10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳迅速点样，先用250 V电泳，10 min后将电
13、压调至120 V，电泳12 h。银染显色后观察是否有不同带型。若有不同带型出现，将其PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司测序，以鉴定碱基突变的类型。1.3 数据分析1.3.1 基因频率和基因型频率。基因频率（Gene frequency）是指群体中某一特定等位基因与其他等位基因的比率；基因型频率（Genotypic frequency）是指群体中某特定基因型个体数占全部个体数的比率。2 结果与分析2.1 Tyrp1基因各外显子的扩增结果对该基因的7个外显子序列进行扩增，并用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。检测扩增片段大小所用的Marker均为DL 500 Marker。从图1可以看出，Tyrp
14、1基因各外显子的条带特异性均较好，杂带较少，特异条带的片段大小与理论值一致。经PCRSSCP检测后，在Tyrp1基因外显子1、3、4、5、6、7中均未检测到多态位点，仅在外显子2上检测到2个等位基因、3种基因型（AA、BB、AB）。2.2 Tyrp1基因多态序列分析使用AlignIR V2.0软件，将测序得到的DNA序列进行对比。从图23可以看出，Tyrp1基因外显子2在29 bp（整个基因CDS的483 bp）处有1个CT的突变，碱基的突变并没有造成氨基酸的改变（AUCAUT，异亮氨酸），为同义突变。2.3 Tyrp1基因外显子2的遗传多样性分析白色和青紫蓝色獭兔外显子2各基因型和基因型频率
15、经卡方适合性检验，BB基因型频率在青紫蓝色獭兔中较高，在白色獭兔中较低，表明等位基因B是青紫蓝色獭兔群体中的优势等位基因，而在白色獭兔中等位基因A是优势等位基因。HardyWeinberg 平衡检验表明，青紫蓝色獭兔群体处于非平衡状态，白色獭兔群体处于平衡状态。青紫蓝兔群体为中度多态信息含量（0.25pic0.50），白色獭兔群体为低度多态信息含量（pic2.4 Tyrp1基因序列分析2.4.1 TYRP1氨基酸序列的理化性质。根据 GenBank数据库上已发表的家兔的Tyrp1基因序列可知，家兔的Tyrp1基因位于1号染色体上，全长15 843 bp，有7个外显子和6个内含子。编码序列由1
16、683个碱基组成，编码560个氨基酸残基，是一个较为保守的基因。经ProtParam在线软件预测，分子式为C2802H4268N786O831S30，原子总数为8 717个，分子量为63 223.2 kD，理论等电点为6.06。在所有编码氨基酸中，Leu（L）含量最高，为8.6%，Trp（W）只占1.8%（表3）。带负电荷残基的总数量（ASP + Glu）为56，带正电荷残基的总数量（Arg+Lys）为47，不稳定指数是52.92，证明这个蛋白质不稳定。/pic0.50），白色獭兔群体为低度多态信息含量（pic从图4可以看出，TYRP1蛋白疏水性最大值为3.711，最小值为-3.133。TYRP1的主要亲水平均数（GRAVY）值是-0.381，由
