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1、一、对象与方法1、 调查样本调查样本涵盖全省11 个市（地） 。2、 调查方法采用随机抽样问卷调查法。调查问卷表格分为ABCD4 类： A 类表的问卷对象为市（地） 及区县卫生局；B 类表的问卷对象为各级医院（包括中医院） ；C 类表的问卷对象为乡镇卫生院；D 类表的问卷对象为村卫生院。3、 需求预测的参考依据4、 需求测算方法采用“需求增长指数”测算方法，测算公式为：需求增长指数（未来需求数现有数）/现有数课堂笔记：1、基本情况的调查报告研究性和预测性调查报告 分类：普遍调查和非普遍调查非普遍调查分为：典型、重点、统计、抽样、问卷2、调查报告的写作要领一、观点和材料的结合，突出观点精选典型事
2、例巧用对比方法运用精确的数字二、 以叙述事实为主，夹叙夹议三、 叙述和议论是调查报告基本的表达方法，而夹叙夹议3、调查报告的实施一、确认调查的方式之前务必要明确的目的是什么？ 问卷调查、直接采访二、调查工作计划的实施A 、多少份有效B、为了达到需要的有效问卷，需要收集多少问卷C、如何激起调查者参与调查时的积极性D、需要所少人力，物力E、调查责任人是谁，相关工作的分工免疫组化实验过程中的要点和技巧1. 固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好； 但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。Boui
3、n S 固定液： 饱和苦味酸750ml ，甲醛 250ml，冰醋酸 50ml ，其对组织的穿透力较强， 固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。PLP 液：即高碘酸钠- 赖氨酸 - 多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。2. 组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。3. 切片时展片： 有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。4. 烤片： 60 30 分钟或 37 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。5. 蜡块及切片的保存：最好在4保存6. 脱片问题：
4、 Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸 ) 为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂， 6ml 的多聚赖氨酸溶液可按1:10 稀释成 60ml 的工作液， 适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和 Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES1： 50 丙酮溶液中浸泡 3 分钟，晾干，即可进行下一步。7. 灭活内源性酶：HRP系统： 3%双氧水灭活； AP 系统： 3%HAc灭活。8. 暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免
5、疫组化染色的强度( 不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书) 。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。9. 封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10. 抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。11. 背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含 1 Tween20 的 PBS洗，特别是在显色之前要多洗。12返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或 Na2HPO4的饱和溶液返蓝。13. 显色
6、：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。14. 在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。（一）、仪器设备1 ）18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2 ）水浴锅（二）、试剂1 ）PBS缓冲液（ pH7.2 7.4 ）：NaCl 137mmol/L ，KCl 2.7mmol/L ，Na2HPO44.3mmol/L ，KH2PO4 1.4mmol/L 。2 ） 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0 ， 1000ml）：柠檬酸三钠3g ，柠檬酸0.4g 。3 ）0.5mol/LEDTA缓冲液（ pH8.0 ）：700ml 水中溶解 186.1gEDTA2H2O，用
7、10 mmol/LNaOH调至 pH8.0, 加水至 1000ml。4 ）1mol/L 的 TBS缓冲液（ pH8.0）：在 800ml 水中溶解121gTris碱，用 1N的 HCl调至 pH8.0, 加水至 1000ml 。5 ）酶消化液：a 、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。 b 、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N 的 HCl 配制。6 ） 3%甲醇 -H2O2 溶液：用30%H2O2和 80%甲醇溶液配制。7 ）封裱剂：a 、甘油和0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.0 9.5 ）等量混合；b 、油和 TBS(或 PBS)配制。8 ） TBS/PBS p
8、H9.0 9.5 ，适用于荧光显微镜标本；pH7.0 7.4 适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程1 、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60 分钟或 60恒温箱中烘烤20 分钟。1 ）组织芯片置于二甲苯中浸泡10 分钟，更换二甲苯后再浸泡10 分钟；2 ）无水乙醇中浸泡5 分钟；3 ） 95%乙醇中浸泡5 分钟；4 ） 70%乙醇中浸泡5 分钟；2 、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1 ）抗原热修复（ 1）高压热修复在沸水中加入EDT（ApH8.0 ）或 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液 （ pH6.0 ）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢
9、加压， 使玻片在缓冲液中浸泡5 分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10 分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（ 2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至 95 左右，放入组织芯片加热1015 分钟。（ 3）微波热修复在微波炉里加热0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（ pH6.0 ）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔510 分钟，反复1-2 次。2）酶消化方法常用 0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37， 切片也预热至37，消化时间约为530 分钟；胃蛋白酶消化37时间为30
10、分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen ，Complement， Cytokeratin，C-erB-2 ，GFAP，LCA， LN 等。3 、免疫组织化学染色SP 法1 ）脱蜡、水化；2 ） PBS洗 2 3 次各 5 分钟；3 ） 3%H2O（2 80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10 分钟；4 ） PBS洗 2 3 次各 5 分钟；5 ）抗原修复；6 ） PBS洗 2 3 次各 5 分钟；7 ）滴加正常山羊血清封闭液, 室温 20 分钟。甩去多余液体。8 ）滴加抗50 l ，室温静置1 小时或者4过夜或者371小时。9 ）4过夜后需在37复温 45 分钟。10 ） PB
11、S洗 3 次各 5 分钟；11 ）滴加抗4050 l ，室温静置，或371小时；12 ） II抗中可加入0.05% 的 tween-20 。13 ） PBS洗 3 次各 5 分钟；14 ） DAB显色 5 10 分钟，在显微镜下掌握染色程度；15 ） PBS或自来水冲洗10 分钟；16 ）苏木精复染2 分钟，盐酸酒精分化；17 ）自来水冲洗10 15 分钟；18 ）脱水、透明、封片、镜检。SABC法1) 脱蜡、水化。2) PBS 洗两次各5 分钟。3) 用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O，2 室温封闭5 10 分钟，蒸馏水洗3 次。4) 抗原修复。5) PBS 洗 5 分钟。分钟）。6) 滴
12、加正常山羊血清封闭液，室温20 分钟。甩去多余液体。7) 滴加抗 , 室温 1 小时或者4过夜或者371小时（4过夜后在37复温 458) PBS 洗三次每次2 分钟。9) 滴加生物素化二抗 ,20 3720分钟。10) PBC 洗 3 次每次 2 分钟。11) 滴加试剂SABC，20 3720分钟。12) PBS 洗 4 次每次 5 分钟。13) DAB 显色： DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14) 蒸馏水洗。苏木素复染2 分钟、盐酸酒精分化。15) 脱水、透明、封片、镜检。动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织( 或器官 ) 取出，模拟动物体内的生
13、理条件，在体外进行培养使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的 影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构( 如细胞骨架等) 、细胞生长及发育等过程的观察。清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。二、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜( 直径 25) ：孔径为 022m，微孔滤膜 ( 直径 90) ：孔径为0. 22 m，过滤器 ( 直径 25) 。药品： 7
14、0或 75酒精， 01新洁尔灭， 煤酚皂溶液 ( 来苏儿水 ) ，05过氧乙酸， 乳酸， 37甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸( 工业 ) ， DEPC水 体积分数 01的焦炭酸二乙酯 (diethylpyroearbonate)。仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。消毒1. 物理消毒法(1) 紫外线消毒用于消毒空气、 操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。(2) 干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160，保温 90 120 min 。用于 RNA提取实验的用品则需180，保温 5 8 h 。(3) 湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品 ( 如胶塞 ) 、金属器械、 玻璃器皿、 某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液( 如Hanks液、 PBS、20SSC等) 。(4) 滤过除菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料 滤器， 配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤膜孔径有 060 m、045 m、035 m、0 22 m、0 10m等，以 0 22 m除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。
