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1、 余甘子叶药材的HPLC指纹图谱研究 毛健+刘振杰摘要 目的 建立余甘子叶的指纹图谱。 方法 采用高效液相色谱法测定，乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，流速1.0 ml/min，柱温25，紫外检测波长218 nm。 结果 余甘子叶中有15个共有峰被确定为指纹峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版计算机软件评价10批余甘子叶指纹图谱的相似性，其结果均0.9。 结论 该方法简便，稳定，精密度高，重现性好，可用于余甘子叶的鉴别，作为质量控制方法。关键词 余甘子叶；高效液相色谱法；指纹图谱 R284.1 A 1674-4721（2014）06（b）-0011-04Study on HPLC fing
2、erprint analysis of Phyllanthus emblica L.MAO Jian1 LIU Zhen-jie21.Department of Clinical medicine,Peoples Hospital of Fuchuan County in Hezhou City of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Fuchuan 542700,China;2.Conservation Center,Guangxi Institute of Medicinal Plant,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Na
3、nning 530023,ChinaAbstract Objective To establish a method of fingerprint analysis on Phyllanthus emblica L. by HPLC. Methods The chromatographic finger-prints were obtained by HPLC.The detective wave-length was set at 218 nm;the flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was maintained at
4、25. Results 15 co-possessing peaks were selected as the fingerprint peaks of Phyllanthus emblica L. and good similarities with correlation coefficients higher than 0.9 were found in fingerprints between the different samples of Phyllanthus emblica L. and the standard fingerprint. Conclusion The meth
5、od with good reproducibility is simple and accurate,it can be used as an effective quality control method for Phyllanthus emblica L.Key words Phyllanthus emblica L.;High performance of liquid chromatography;Fingerprint余甘子叶（Phyllanthus emblica L.）系大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）余甘子Phyllanthus emb
6、lical L.落叶小乔木或灌木的叶1，余甘子树在我国资源丰富，收载于1978年版藏药标准、1974年出版的云南省药品标准和多版中华人民共和国药典，别名有橄榄、滇橄榄、油甘子、山油甘、庵摩勒、牛甘子、喉甘子、杨甘等,余甘子果果实生食酸甜酥脆，初食味酸涩，后回味甘甜爽口，故名余甘2。余甘子味甘、酸、涩、性凉，具有化痰止咳，健胃消食，清热生津，保肝解毒等功效3。主治感冒发热、咳嗽、咽喉痛、白喉、烦热口干、消化不良、腹痛、慢性肝炎、高血压、肥胖症、高脂血症、湿热性水肿、尿频、血病、赤巴病、培根病、肝病、心脏病，以治疗血热血瘀引起的血病为长4。近年研究表明余甘子具有抗菌5、抗肿瘤6、抗氧化7、抗动脉粥
7、样硬化8-9、抗乙型肝炎病毒10、保肝11、增强免疫12-13等作用。余甘子有多种化学成分，药理活性研究主要集中在多酚类成分上，槲皮素、没食子酸为其有效成分14-15。本实验对余甘子叶进行指纹图谱研究，以期对其质量控制和评价提供有效方法。1 实验材料1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪；含在线真空脱气机；高压四元梯度泵；可变波长检测器；二极管阵列检测器Agilent1100；Series色谱工作站（美国安捷伦科技公司）；SB3200T超声波清洗仪（上海能信超声有限公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯）。1.2 试剂 甲醇、乙腈为色谱纯，乙酸乙酯、磷酸及其他试剂均为分析纯
8、。水为超纯水。槲皮素对照品和没食子酸对照品由中国药品生物制品检定所提供（槲皮素对照品批号：110081-200406；没食子酸对照品批号：110831-200302）。1.3 药材 实验所用余甘子叶药材于广西各地及云南玉溪收集，产地和采收时间见表1，经广西中医学院药用植物教研室刘寿养副教授鉴定为余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥叶。表1 余甘子叶产地和批号2 方法与结果2.1 供试品溶液制备取余甘子叶粗粉1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 ml，密塞，称重量。静置1 h，超声30 min后放冷，补重，滤过，精密量取续滤液20 ml，挥干，残渣用25 m
9、l水溶解至分液漏斗中，加入乙酸乙酯振摇提取3次，每次25 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液为供试品溶液。2.2 提取溶剂的考察比较水、无水乙醇、甲醇等提取溶剂，结果表明以甲醇、无水乙醇提取时，所得的色谱图中的色谱峰数较多；余甘子叶的现代研究表明，没食子酸和槲皮素为余甘子叶的有效成分，所以以其没食子酸和槲皮素含量计算，用甲醇为溶剂，药材中没食子酸和槲皮素提取较完全16。经综合考虑，选定提取溶剂为甲醇。2.3 超声时间的考察样品分别超声20、30、40 min，结果表明，超声的时间为30 min以上，以其没食子酸和槲皮素含量计
10、算，药材提取较完全。故选定提取时间为超声30 min。2.4 色谱条件色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18（5 m，4.6 mm250 mm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱（表2）；柱温25；检测波长218 nm；进样量5 l。表2 流动相梯度洗脱程序2.5 方法学考察2.5.1 精密度试验取批号为200701药材，制备供试品溶液，连续进样5次，各色谱峰的相对保留时间RSD1.42%，相对峰面积RSD2.94%，结果表明，仪器的精密度良好。2.5.2 稳定性试验取批号为200701药材，制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24 h进样检测共有峰的相对保留时间
11、RSD1.30%，相对峰面积RSD2.5.3 重重复性试验精密称取批号为200701药材5份，制备供试品溶液，连续进样，共有峰的相对保留时间RSD1.65%，相对峰面积RSD0.9，分别为0.966、0.969、0.973、0.981、0.931、0.902、0.963、0.955、0.983、0.974，表明各批次余甘子叶药材与对照指纹图谱有较好的一致性。3 讨论余甘子叶药材的成分复杂，本文通过调节流动相洗脱程序，使各成分在整个分析时间段内充分分离洗脱。在流动相系统的选择，本文考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸系统，结果表明各成分在乙腈-水、甲醇-水中无法分离，峰形差。在酸性流
12、动相中，磷酸可改善其分离度与峰形，对比甲醇-磷酸系统、乙腈-磷酸，前者洗脱能力较弱，各组分出峰时间太慢，色谱图基线漂移，不能达到中药指纹图谱色谱峰基线分离的要求，故本文选用乙腈-磷酸系统。经过多次优化发现在100 min内能较好地分离余甘子叶中各组分，重现性良好。本文考察了三种不同的色谱柱对指纹图谱的影响，结果表明，同一色谱方法，不同色谱柱，会产生不同的分离效果，使得某些成分无法达到基线分离，同时，对柱效、峰形也有不同程度的影响。美国热电BDS色谱柱在实验过程中能使各主要有效成分有较好的分离效果，故本文选择了美国热电BDS色谱柱。余甘子叶中已知成分有没食子酸、槲皮素，两者最大吸收波长为270
13、nm和370 nm，本文根据此特点，用二极管阵列检测器，分别在210、218、258、270、280、300、360 nm检测色谱图，并同时获得全波长三维色谱图，结果表明218 nm的色谱图能给出最多峰信息，故本文最终选定218 nm为检测波长。实验结果显示，10批指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，但各成分的共有色谱峰峰面积存在一定差异。此研究为快速鉴别和区分不同来源的余甘子叶以及进一步对其进行全面质量控制研究提供了科学的依据，同时对于余甘子叶药材的选购和用药具有一定的指导作用。参考文献1卫生部药典委员会.中华人民共和国药典（一部）M.北京：中国医药科技出版社，2010：167.2王辉.余
14、甘子的化学成分和药理作用研究进展J.中国现代中药，2011，13（11）：52.3周涛，邱德文.民族药余甘子的本草药学概况J.贵阳中医学院学报，2002，24（3）：3.4罗兰.闽药余甘子药理作用及提取分离方法研究进展J.海峡药学，2013，25（11）：185钟振国，曾春兰.余甘子叶提取物体外抗菌实验研究J.中药材，2008，31（3）：428.6曾春兰，钟振国.余甘子叶提取物体外抗肿瘤作用研究J.时珍国医国药，2008，19（3）：580.7潘国庆，赵旭升，蒋炘治.余甘子抗氧化作用的研究J.青海科技，2007，12（6）：33.8王绿娅，王大全，秦彦文，等.余甘子抗脂质过氧化和保护血管内皮的实验研究J.中国药学杂志，2003，38（10）：505.9刘丽梅，高政，李宝文.余甘子对实验性颈动脉粥样硬化家兔的影响J.中国临床康复，2003，7（5）：766.10黄
