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1、满天星异茲草昔对大鼠酒精性肝纤维化保护作用实验探究摘要目的：研究满天星异茲草昔对乙醇诱导形成 的大鼠肝纤维化的干预作用及其机制。方法：90只雄性大鼠 随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组（灌胃给予秋水仙碱1、0 mg kg-1 d-1）、异茲草昔低、中、高剂量组（灌胃给予异茲草昔25, 50, 100 mg - kg-1d-1）。实验过程中，模型组大鼠仅灌胃给予白酒，治疗组在给白酒的同时灌胃相应的药物，正常组则只灌胃等量的生 理盐水。给药24周后，各组大鼠眼球取血、取肝脏，并测 定血浆白细胞介素-6 （IL-6）,人肿瘤坏死因子-a （TNF- a ）和血清谷丙氨酸氨基转移酶
2、（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、透明质酸（HA）,层粘连蛋白（LN）, HI型胶原（PCIII）和餐基脯氨酸（Hyp）的含量，检测肝组织髓过氧化物酶（MP0）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（S0D）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，Western blot检测a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）和转化生长因子-Bl （TGF-B1）的 表达，以及肝组织病理检查。结果：异茲草昔能够保护受损 的肝组织，降低 ALT, AST, IL-6, TNF- a , MDA, MPO, HA,LN, PCIII和Hyp的含量（P 血清中HA, LN, PCIII的含量采用放射免疫测定法（R
3、IA）检测。肝组织中Hyp的含 量测定严格按照试剂盒的说明书进行操作。2、6 Western blot检测肝组织中a-SMA表达水平用 总蛋白提取试剂盒提取各组肝组织的总蛋白,Bradford法对 蛋白样品进行定量。取出30 ug蛋白样品至EP管中，加 入4XSDS上样缓冲液至终浓度为1XSDS, 95 C煮10 min 进行蛋白质变性，再进行100 g L-1的SDS-PAGE凝胶电泳, 然后将蛋白质转至硝酸纤维膜上，用50 g - L-1的脱脂牛奶 于4 C封闭过夜后，分别用a -SMA抗体(1 ： 200), B-actin (1 : 1 000) 4 孵育过夜，然后加入辣根过氧化物酶标
4、记 的山羊抗小鼠TgG抗体(1 ： 1万)室温2ho最后加ECL发 光剂于暗室充分反应后用胶片曝光。将每个样本所测得的 a-SMA蛋白灰度值，分别与对应的0 -actin蛋白的灰度值 相比，计算二者灰度比值。2、7肝组织中TGF-B 1的检测 分别取各组50 mg肝组 织，加1 mL蛋白裂解液(裂解液组成：50 mmol L-1 Tris, 150 mmol L-1 NaCl, 5 mmol L-1 EDTA, 0、1% SDS, 1%NP-40, 1 mg L-1 Aprotinin ,1 mg L-lLeupeptin ,1 mg L-lPepstatin, 2 mmol - L-1PMS
5、F),裂解 30 min, 4 C, 12 000 r min-1离心10 min,取上清，BCA法蛋白定量。加入 上清缓冲液，100 加热5 mino每孔上样20 uL总蛋白， 12% SDS-PAGE进行电泳，在转移缓冲液中，以100 mA的电 流转移到PVDF膜上。PVDF膜用含5%牛奶的TBST液封闭2 h,加入大鼠抗TGF-B 1单抗，4。（2孵育过夜。继以相匹配的辣 根过氧化物酶结合的二抗室温孵育2 h, ECL试剂盒显色， B-actin为内参，用图像处理系统进行分析。2、8统计分析实验数据以SPSS 16、0统计软件进行 统计学处理，以土s表示，用t检验进行组间比较，检验水准以
6、P本实验采用乙醇灌胃的方法制备大鼠肝纤维化动物模型。实验结果表明，酒精性肝纤维化初期为不同程度 的肝细胞脂肪变性。随着造模时间延长、乙醇摄入量的增多 及动物体内多种有害因素协同作用，肝细胞出现脂代谢、糖 代谢紊乱，细胞外基质（ECM）大量合成并在肝窦周围、胆 管周围、汇管区、中央静脉周围等处沉积下来，形成肝纤维 化。在酒精性肝纤维化形成过程中还同时伴随着肝功能标志 物的改变及血清纤维化标志物的变化5。上述病理变化与 酒精性肝病的临床表现基本符合。长期饮酒会导致机体内促氧化物质明显增多、抗氧化物 质减少，促生氧化应激，最终造成肝细胞坏死或凋亡6, 激发肝组织的炎症反应，从而引起酒精性肝纤维化。肝
7、细胞 发生损伤时，肝细胞通透性增加，酶从肝细胞内外溢进入血 液，使血液中ALT, AST浓度急剧升高。肝内胶原纤维的不 断增加，也会促使肝纤维化的发生和发展，而胶原的沉积和 降解受多种细胞因子调控，其中IL-6及TNF- a调控尤为重 要7-9 o IL-6及TNF-a在肝硬化的发生发展中参与肝脏的 损伤-修复循环，引起大量ECM的合成和沉积10 o本实验 中，满天星异茲草昔能显著降低肝纤维化大鼠中ALT, AST, HA, LN, PCIII, Hyp, MDA, IL-6, TNF-a 及 MPO 的含量, 提高SOD, GSH-Px的活性，表明了满天星异茲草昔能显著清 除体内氧自由基，抑
8、制促炎介质释放，降低胶原纤维的堆积, 对脂质过氧化反应具有明显的抑制作用。肝星状细胞（HSC）是肝纤维化ECM的主要来源细胞，HSC的活化、增殖是肝纤维化发生的中心环节。HSC被激活 后，通过自分泌及旁分泌细胞因子促进未转化的HSC向肌成 纤维转化,并表达a-SMA,产生大量的ECME11,因此，a-SMA 常作为HSC活化的标志；TGF-B 1被认为是促纤维化作用最 强的因子之一，促进ECM的合成，加速肝纤维化进程12-14 o 有研究表明15,调控TGF-B表达可逆转肝纤维化。因此, 抑制HSC增殖、诱导HSC凋亡是治疗肝纤维化的重要策略。 本实验证实，满天星异茲草昔能显著下调肝组织a-S
9、MA和 TGF-B1的表达，提示满天星异茲草昔诱导肝细胞凋亡的机 制可能与抑制a-SMA和TGF-B 1的表达有关。本次实验研究表明，满天星异茲草昔能有效的抑制脂质 过氧化反应、减轻肝组织病理损伤、促进肝星状细胞凋亡等, 提示满天星异茲草昔对乙醇引起的肝纤维化具有明显抑制 作用，是治疗酒精性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新 药，值得进一步研究。参考文献1 张凤梅，太志刚，蔡乐，等、满天星中的黄酮类化合物及其抗氧化活性J、云南大学学报：自然科学版, 2011,33(1)：93、2 Zhang X H, Yan M, Liu L, et al、 Expression of discoidin do
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