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1、满天星异茲草昔对大鼠酒精性肝纤维化保护作用实验探究摘要目的:研究满天星异茲草昔对乙醇诱导形成 的大鼠肝纤维化的干预作用及其机制。方法:90只雄性大鼠 随机分为6组,分别为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组(灌胃给予秋水仙碱1、0 mg kg-1 d-1)、异茲草昔低、中、高剂量组(灌胃给予异茲草昔25, 50, 100 mg - kg-1d-1)。实验过程中,模型组大鼠仅灌胃给予白酒,治疗组在给白酒的同时灌胃相应的药物,正常组则只灌胃等量的生 理盐水。给药24周后,各组大鼠眼球取血、取肝脏,并测 定血浆白细胞介素-6 (IL-6),人肿瘤坏死因子-a (TNF- a )和血清谷丙氨酸氨基转移酶
2、(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA),层粘连蛋白(LN), HI型胶原(PCIII)和餐基脯氨酸(Hyp)的含量,检测肝组织髓过氧化物酶(MP0)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(S0D)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,Western blot检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和转化生长因子-Bl (TGF-B1)的 表达,以及肝组织病理检查。结果:异茲草昔能够保护受损 的肝组织,降低 ALT, AST, IL-6, TNF- a , MDA, MPO, HA,LN, PCIII和Hyp的含量(P 血清中HA, LN, PCIII的含量采用放射免疫测定法(R
3、IA)检测。肝组织中Hyp的含 量测定严格按照试剂盒的说明书进行操作。2、6 Western blot检测肝组织中a-SMA表达水平用 总蛋白提取试剂盒提取各组肝组织的总蛋白,Bradford法对 蛋白样品进行定量。取出30 ug蛋白样品至EP管中,加 入4XSDS上样缓冲液至终浓度为1XSDS, 95 C煮10 min 进行蛋白质变性,再进行100 g L-1的SDS-PAGE凝胶电泳, 然后将蛋白质转至硝酸纤维膜上,用50 g - L-1的脱脂牛奶 于4 C封闭过夜后,分别用a -SMA抗体(1 : 200), B-actin (1 : 1 000) 4 孵育过夜,然后加入辣根过氧化物酶标
4、记 的山羊抗小鼠TgG抗体(1 : 1万)室温2ho最后加ECL发 光剂于暗室充分反应后用胶片曝光。将每个样本所测得的 a-SMA蛋白灰度值,分别与对应的0 -actin蛋白的灰度值 相比,计算二者灰度比值。2、7肝组织中TGF-B 1的检测 分别取各组50 mg肝组 织,加1 mL蛋白裂解液(裂解液组成:50 mmol L-1 Tris, 150 mmol L-1 NaCl, 5 mmol L-1 EDTA, 0、1% SDS, 1%NP-40, 1 mg L-1 Aprotinin ,1 mg L-lLeupeptin ,1 mg L-lPepstatin, 2 mmol - L-1PMS
5、F),裂解 30 min, 4 C, 12 000 r min-1离心10 min,取上清,BCA法蛋白定量。加入 上清缓冲液,100 加热5 mino每孔上样20 uL总蛋白, 12% SDS-PAGE进行电泳,在转移缓冲液中,以100 mA的电 流转移到PVDF膜上。PVDF膜用含5%牛奶的TBST液封闭2 h,加入大鼠抗TGF-B 1单抗,4。(2孵育过夜。继以相匹配的辣 根过氧化物酶结合的二抗室温孵育2 h, ECL试剂盒显色, B-actin为内参,用图像处理系统进行分析。2、8统计分析实验数据以SPSS 16、0统计软件进行 统计学处理,以土s表示,用t检验进行组间比较,检验水准以
6、P本实验采用乙醇灌胃的方法制备大鼠肝纤维化动物模型。实验结果表明,酒精性肝纤维化初期为不同程度 的肝细胞脂肪变性。随着造模时间延长、乙醇摄入量的增多 及动物体内多种有害因素协同作用,肝细胞出现脂代谢、糖 代谢紊乱,细胞外基质(ECM)大量合成并在肝窦周围、胆 管周围、汇管区、中央静脉周围等处沉积下来,形成肝纤维 化。在酒精性肝纤维化形成过程中还同时伴随着肝功能标志 物的改变及血清纤维化标志物的变化5。上述病理变化与 酒精性肝病的临床表现基本符合。长期饮酒会导致机体内促氧化物质明显增多、抗氧化物 质减少,促生氧化应激,最终造成肝细胞坏死或凋亡6, 激发肝组织的炎症反应,从而引起酒精性肝纤维化。肝
7、细胞 发生损伤时,肝细胞通透性增加,酶从肝细胞内外溢进入血 液,使血液中ALT, AST浓度急剧升高。肝内胶原纤维的不 断增加,也会促使肝纤维化的发生和发展,而胶原的沉积和 降解受多种细胞因子调控,其中IL-6及TNF- a调控尤为重 要7-9 o IL-6及TNF-a在肝硬化的发生发展中参与肝脏的 损伤-修复循环,引起大量ECM的合成和沉积10 o本实验 中,满天星异茲草昔能显著降低肝纤维化大鼠中ALT, AST, HA, LN, PCIII, Hyp, MDA, IL-6, TNF-a 及 MPO 的含量, 提高SOD, GSH-Px的活性,表明了满天星异茲草昔能显著清 除体内氧自由基,抑
8、制促炎介质释放,降低胶原纤维的堆积, 对脂质过氧化反应具有明显的抑制作用。肝星状细胞(HSC)是肝纤维化ECM的主要来源细胞,HSC的活化、增殖是肝纤维化发生的中心环节。HSC被激活 后,通过自分泌及旁分泌细胞因子促进未转化的HSC向肌成 纤维转化,并表达a-SMA,产生大量的ECME11,因此,a-SMA 常作为HSC活化的标志;TGF-B 1被认为是促纤维化作用最 强的因子之一,促进ECM的合成,加速肝纤维化进程12-14 o 有研究表明15,调控TGF-B表达可逆转肝纤维化。因此, 抑制HSC增殖、诱导HSC凋亡是治疗肝纤维化的重要策略。 本实验证实,满天星异茲草昔能显著下调肝组织a-S
9、MA和 TGF-B1的表达,提示满天星异茲草昔诱导肝细胞凋亡的机 制可能与抑制a-SMA和TGF-B 1的表达有关。本次实验研究表明,满天星异茲草昔能有效的抑制脂质 过氧化反应、减轻肝组织病理损伤、促进肝星状细胞凋亡等, 提示满天星异茲草昔对乙醇引起的肝纤维化具有明显抑制 作用,是治疗酒精性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新 药,值得进一步研究。参考文献1 张凤梅,太志刚,蔡乐,等、满天星中的黄酮类化合物及其抗氧化活性J、云南大学学报:自然科学版, 2011,33(1):93、2 Zhang X H, Yan M, Liu L, et al、 Expression of discoidin do
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