质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定!1!!1!［实验目的］训练学生正确使用加样器；了解限制性内切酶及酶切条；学会分析质粒DNA 的酶切图谱；系统掌握琼脂凝胶电泳的基本技术［实验原理］限制性内切核酸酶（也口J称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰 现象中发现的细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用） 和DNA T基化酶（修饰作用）它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功 能却相反由于细胞毎存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干 碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染 的外來噬菌体DNA,因无甲基化而被切割破坏所以限制性内切酶是该细菌细 胞的卫士，它与DNA甲基化酶一齐构成了保护口己、抵抗外源入侵的DNA防御 机制目前已发现的限制性内切酶有数百种EcoR I和Hind III都属于II型限制性 内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子的特界核昔酸顺序的能力, 能在这个特异性核昔酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA 片断EcoR I和Hind III的识别序列的切口是:EcoR I : GJAATTCHind III: A^AGCTTGA等核苛酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。
限制性内切酶对环状质 粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段，因此鉴定酶切后的片断在电泳 凝胶中的区带数，就口J以推断酶切口的数目，从片断的迁移率可以人致判断酶切 片段大小的羌别用已知相对分了质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的 比较，可以粗略地测岀分子形状相同的未知DNA的相对分子质量［实验器材］1 •仪器和材料 电泳仪、电泳槽，样品槽横板（梳子），有机玻璃内槽，橡皮膏，锥形瓶（lOOmL 或50mL）,玻璃纸，一次性塑料手套pUC19 （市售和自捉），EcoR I酶，入DNA- Hind III酶切的分子量标准、琼脂糖 2•试剂（1） TAE 缓冲液（1XTAE）：称取 Tris 4・9g、EDTA・Na2 —2H2O 0.74g,用 900ml蒸憾水分别溶解后，添加冰醋酸1.14ml,最终用蒸徭水定容至1L2） 酶反应终止液（10X）：两种反应终止液可供选择①0.1mol/L EDTA-Na2, 20%FiCoLL,适量橙G② 0.25%溟酚蓝，0.25%二甲苯青FF （或称二甲苯蓝）,40%蔗糖水溶液（m/V）（或 用30%蔗糖水溶液）［实验步骤］1, 质粒DNA的酶解编号123456市售的pUC19 （微升）003300自提的pUC19 （微升）660066EcoR I （微升）202020Buffer 5 X222222H20/ （微升）023502总体积/ （微升）101010101010质粒DNA酶解的反应成分及加样量2, 琼脂糖凝胶板的制备（1） 琼脂糖凝胶的制备：称取0.14g琼脂糖，置于蓝盖试剂瓶中，加入20ml TAE缓冲液，置于高压灭菌锅内加热，锅内压力为至121kPa时维持lOmin,琼 脂糖即可全部融化在缓冲液中，取出摇匀，则为0.7%琼脂糖凝胶液。
2） 胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干3） 放好样品加样孔合适的梳子4） 将冷却至65度左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制 灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层室 温下静置30min左右5） 待凝胶完全凝固后，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽内备用，加入足量 电泳缓冲液6） 轻轻拔出梳子3, 加样（1） 预先染色DNA（2） 用微量加样器将样品加入胶版的样品小槽内，加样时枪头垂宜于样品槽上 方，注意不能碰到样品槽的凝胶面3） 每次加完一个样品，及时更换枪头，以防止相互污染加样时，应防止碰 坏样品槽周围的凝胶面4, 电泳正确连接正负极，DNA向正极移动加完样品后的凝胶板立即通电，进行电泳但要注意控制一定的条件，样品 进胶前，应使电流控制在30mA,样品进胶后电流为30mA当橙G或澳酚兰染料移动到距离胶板下沿约1〜2cm处，停止电泳5,拍照观察［实验结果］［结杲分析］。