《猪传染性胃肠炎病毒S1融合蛋白的构建及其免疫原性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪传染性胃肠炎病毒S1融合蛋白的构建及其免疫原性研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 猪传染性胃肠炎病毒S1融合蛋白的构建及其免疫原性研究 王芳徐进平摘要 目的研究猪传染性胃肠炎病毒S1融合蛋白的免疫原性。方法表达和纯化了猪传染性胃肠炎病毒S1与TAT转导肽序列的融合蛋白S1-TAT，将融合蛋白S1-TAT经腹腔注射和灌胃方式免疫昆明小鼠，采集免疫小鼠血液和粪便样品，检测血清IgG抗体和黏膜IgA抗体水平，期间观察小鼠体重变化。结果腹腔注射组诱导产生的血清IgG抗体水平明显高于其他试验组（P0.01），但其黏膜IgA抗体水平较低；而灌胃组能够诱导中等水平的血清IgG抗体和较高水平的黏膜IgA抗体（P0.01）；在试验周期中，各组小鼠体重均正常。融合蛋白S1-TAT的穿肠活性较
2、好，与对照组之间差异极显著（P0.01）。结论融合蛋白S1-TAT经口服或注射小鼠后，能够有效诱导小鼠机体产生体液免疫应答，并且融合蛋白S1-TAT经口服可诱导小鼠机体产生黏膜免疫应答；融合蛋白S1-TAT具有穿肠功能；融合蛋白S1-TAT经口服或注射小鼠，均安全。关键词 猪传染性胃肠炎病毒S1基因；转导肽；免疫原性S852.5 A 0517-6611（2018）13-0104-04Construction and Immunogenicity of Transmissible Gastroenteritis Virus S1 Fusion ProteinWANG Fang，XU Jinpin
3、g（State Key Lab of Viral，School of Life Science，Wuhan University，Wuhan，Hubei 430072）Abstract Objective To investigate the immunogenicity of fusion protein S1TAT consisting of transmissible gastroenteritis virus S1 and transcriptional activator protein （TAT）. Method The recombinant plasmid S1TAT was
4、expressed in prokaryotic system and purified. Kunming mice were immunized with fusion protein S1TAT by intraperitoneal injection and intragastric administration respectively， collected the blood and stool samples of mice and determined for serum IgG and mucosal IgA antibody， observed the change of b
5、odyweight. Result The level of serum IgG antibody of intraperitoneal injection group was significantly higher than other groups （PKey words Transmissible gastroenteritis virus S1 gene；Transduction peptide； Immunogenicity豬传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）是一种可以引起以幼猪呕吐、腹泻和高死亡率为主要特征的急性传
6、染肠道疾病的RNA病毒1。纤突糖蛋白S作为诱导保护免疫的主要结构蛋白2-3，在其氨基末端S1区域含有4个主要抗原位点，从N端到C端依次是C、B、D和A4。A位点是能够诱导机体产生中和抗体的关键糖基化位点5，存在于病毒粒子的表面上；D位点虽不经过细胞内的糖基化修饰作用，但应用仅含D抗原位点基因免疫小鼠产生的血清特异性抗体也具有中和活性。如果S基因中缺乏A、D这2个位点，那么表达的蛋白质就不能诱导机体产生中和抗体6-7。另外有研究表明，TGEV S1基因诱导产生的免疫效果要优于S全基因8-9。目前，TGEV S1基因已在多种不同的表达系统中得到了有效的表达10，但在通过口服方式免疫动物时，由于各种
7、消化酶作用以及本身大分子性质，达不到很好的免疫效果。该研究借助能够携带外源蛋白穿过细胞膜的TAT转导肽序列11-13，将其与S1基因进行融合表達，比较融合蛋白S1-TAT以不同给药方式免疫小鼠产生的免疫效果，为TGEV口服疫苗的研究提供一种新的思路。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒。大肠杆菌E.coli BL21 （DE3）、质粒pGEX-6p-1为武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室保存。1.1.2 生化试剂。质粒小提取试剂盒和ELISA试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，Bio-Rad ECL化学发光检测试剂盒（170-5061）、GST-Resin纯化柱购自七海生物，
8、HRP标记的羊抗鼠IgG和HRP标记的羊抗鼠IgA购自佰泰科生物技术有限公司，抗GST血清为武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室保存。1.1.3 试验动物。SPF级别68周龄的雄性昆明小鼠购自湖北省疾控中心的实验动物研究中心。1.2 方法1.2.1 基因合成与鉴定。参照TGEV TH-98株S1基因序列（KU729220），在S1基因C端融合TAT转导肽序列，并将重组基因S1-TAT克隆至表达载体pGEX- 6p-1中。用pGEX -6p-1通用引物（上游引物F：5-GGGCTGGCAAGCCACG TTTGGTG-3；下游引物R：5-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3）扩
9、增S1-TAT基因，经BamH /EcoR双酶切及基因测序鉴定重组质粒为pGEX-6p-1-S1-TAT。1.2.2 重组工程菌的制备。将实验室保存的大肠杆菌E.coli BL21 （DE3） 接种于LB液体培养基中，37 振荡培养至OD600为0.6左右。取1.5 mL菌液离心，弃上清，加入200 L预冷的0.1 mol/L氯化钙轻轻摇动重悬菌体沉淀，冰浴30 min。4 、4 000 r/min离心10 min后弃上清，加入100 L预冷的0.1 mol/L氯化钙重悬菌体，得到制备好的E.coli BL21 （DE3） 感受态细胞。取1 L重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT转化E.c
10、oli BL21 （DE3） 感受态细胞，将转化产物均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37 培养过夜，经菌液PCR鉴定阳性重组子。1.2.3 融合蛋白S1-TAT的表达与纯化。挑取转化有重组质粒的单菌落接种于5 mL选择性LB液体培养基中，37 过夜培养。次日，按1 100的比例转接到20 mL选择性LB液体培养基中，37 振荡培养至OD600约为0.6时，加入0.5 mmol/L的IPTG诱导剂，30、250 r/min振荡培养4 h。将菌液在4 、10 000 r/min离心1 min，收集菌体沉淀，加入pH 7.4 PBS缓冲液进行重悬，400 W超声破碎至菌液不再黏稠后，12 000
11、 r/min离心10 min，取少量样品加入适当上样缓冲液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和Western blot分析。将破碎上清溶液与GST纯化柱在4 孵育过夜，4 、3 000 r/min离心5 min。缓慢去除上清液，加入PBS清洗杂蛋白，4 、3 000 r/min离心5 min。缓慢去除上清液后，加入pH 8.0 Elution buffer，室温轻摇10 min，4 、3 000 r/min离心5 min，收集上清液，SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化情况。1.2.4 试验动物分组、免疫和采样。将昆明小鼠随机分4组，每组8只。融合蛋白S1-TAT分别经腹腔注射和灌胃给药免疫昆明小
12、鼠，每只小鼠每次免疫剂量100 g，共免疫3次，间隔14 d以相同剂量加强免疫1次，同时设置PBS对照。在首次免疫后的第7、14、21、28、35和42天收集免疫小鼠血液和粪便样品：全血37 静置1 h后，4 放置过夜，次日4 、2 000 r/min离心20 min，分离血清；每0.1 g粪便用200 L 0.01 mol/L的PBS充分混匀，4 作用1.5 h，离心收集上层液体。1.2.5 抗体检测。将融合蛋白S1-TAT以100 L/孔包被酶标板，4 放置过夜；次日弃除孔中液体，PBST反复洗涤3次，按200 L/孔加入5%脱脂奶粉，37 封闭2 h；弃除孔中液体，PBST洗涤3次，按1
13、00 L/孔加入适当倍数稀释好的待检样品，37 孵育2 h；弃除孔中液体，PBST洗涤5次，按100 L/孔加入1 5 000稀释的二抗（HRP标记羊抗鼠IgG抗体或HRP标记羊抗鼠IgA抗体），37 孵育2 h；弃除孔中液体，PBST洗涤5次，每孔加入100 L OPD底物溶液，避光显色5 min后终止反应，测定样品的OD值。1.2.6 迟发型超敏反应。将融合蛋白S1-TAT与氟氏完全佐剂按比例充分混匀后注射于小鼠的右后足垫皮下，注射量为10 g，并在同一小鼠左后足垫皮下注射PBS缓冲液。用千分卡尺测量注射抗原后24、48、72 h以及7、14 d小鼠的左右足垫厚度，观察肿胀的发生和消长情况
14、，结果以+、+、-表示（+代表明显肿胀；+代表轻度肿胀；-代表无肿胀）。1.2.7 融合蛋白S1-TAT的穿肠活性检测。取5 cm昆明小鼠肠管，用PBS缓冲液冲洗小鼠肠管，将肠管一端扎紧，用移液枪吸取浓度为100 g/mL的融合蛋白S1-TAT至扎好的小鼠肠管，扎好肠管另一端，投入装有10 mL PBS缓冲液的试管中，并使PBS缓冲液完全浸没小鼠肠管，设置阴性对照，30 下静置，间隔1 h取样，ELISA方法检测待检样品。2 结果与分析2.1 重组质粒的鉴定 重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT为模板，用引物扩增S1-TAT序列，PCR鉴定重组质粒。用BamH 和EcoR 酶双酶切重组质粒
15、pGEX-6p-1-S1-TAT，酶切鉴定重组质粒。结果如图1所示，PCR和双酶切后，瓊脂糖凝胶电泳均见有1.2 kb的S1-TAT基因。经后续测序鉴定，重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT构建正确。2.2 融合蛋白S1-TAT的诱导表达 将重组质粒pGEX-6p-1-S1-TAT转化大肠杆菌E.coli BL21 （DE3） 以0.5 mmol/L IPTG、30 诱导表达4 h。诱导后的S1-TAT原核表达重组大肠菌在分子量约为70 kD出现特异性蛋白条带，与预期的融合蛋白大小基本一致（图2）。相对应未经诱导的重组大肠菌没有出现此条带，而诱导的空载体pGEX-6p-1对照重组大肠菌在2
16、6 kD左右出现GST蛋白条带，上述结果初步表明融合蛋白S1-TAT在大肠杆菌中获得表达。2.3 融合蛋白S1-TAT的Western blot鉴定结果 将重组表达菌E.coli BL21（DE3） （pGEX-6p-1-S1-TAT） 进行小量诱导，诱导后的菌体经过SDS-PAGE电泳分离后转移到NC膜上，ECL化学发光检测结果。结果显示，这些表达与GST融合的蛋白能被抗GST的单克隆抗体识别，蛋白条带大小与预期符合，证实融合蛋白S1-TAT在大肠杆菌中得以表达正确（图3）。2.4 融合蛋白S1-TAT的纯化 收集诱导后E.coli BL21（DE3） （pGEX-6p-1-S1-TAT） 破碎液上清，将其与GST纯化柱4 过夜孵育后，用适量PBS洗去杂蛋白，最后用p
