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1、 比色法测定大血藤中总黄酮含量及其清除DPPH自由基研究 王伟+邹金美+黄冰晴+赵晓丹+洪雅珍+张国广摘要：以中药材大血藤Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils的乙醇提取物为对象，提出1种基于比色法的大血藤总黄酮测定方法，同时考察了提取物对DPPH自由基的清除能力。结果表明，以芸香苷为标准品的亚硝酸钠-硝酸铝显色法更适合大血藤提取物中总黄酮含量的测定，测定波长为510nm，芸香苷在00.5mg/mL范围内，质量浓度与吸光度呈良好的线性关系，平均加样回收率为99.3%，精密度、稳定性、重现性均理想；抗氧化活性试验结果表明大血藤提取物具有很强的清除DPPH自由基
2、能力。关键词：大血藤；总黄酮；紫外-可见分光光度法；抗氧化性；自由基：R284.2文献标志码：A：1002-1302（2014）11-0356-03中药大血藤是木通科植物大血藤Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils.的干燥藤茎，具有清热解毒、活血、祛风止痛等功效，主治肠痈腹痛、热毒疮疡、经闭、跌扑肿痛、风湿痹病等症，主要产自湖北省、四川省、江西省、浙江省、江苏省、福建省等地。大血藤在不同地区名称不一，中药大辞典记录的别名有：血藤、过山龙、红藤、千年健、血竭、血通、大活血、活血藤等10多种1。研究表明，大血藤含有多种化学成分，包括黄酮类、酚类、有机酸、木脂素、
3、三萜皂苷、蒽醌类、糖苷类等物质，具有抑菌、抗炎、抗病毒、抑制血小板聚集、增加冠脉血流量、抗心肌等功效2-6。黄酮类化合物具有较强的抗氧化、抗肿瘤、抗炎镇痛、抗病毒、保肝护肝、保护心血管系统、抑菌、抗衰老、提高免疫力等功效。大血藤中黄酮类化合物受到很多研究者的关注7-13。本研究以中药材大血藤的乙醇提取物为对象，提出一种基于比色法的大血藤总黄酮测定方法，同时考察了提取物对DPPH自由基的清除能力，旨在为开发利用大血藤资源提供依据。1材料与方法1.1材料大血藤药材购于福建省漳州市某中药店。槲皮素与芸香苷标准品均购于中国食品药品检定研究院。DPPH购于梯希爱（上海）化成公司；无水乙醇、氯化铝、亚硝酸
4、钠、硝酸铝、氢氧化钠、维生素C等药品均为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂公司。RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；AR124CN电子分析天平（美国奥豪斯公司）；超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；UV-1750紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）；MultiskanGO全波长酶标仪（美国Thermo公司）；ZWY-2102C全温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。1.2样品溶液的制备用粉碎机将大血藤药材充分粉碎，准确称取药材粉末0.5g，置于烧杯中，加入60%乙醇50mL，封口后放入全温摇床120r/min60振荡浸提24h。浸提结
5、束后超声破碎提取30min，超声破碎程序设定为超声15s，间歇15s，超声频率40Hz，功率1000W。超声结束后抽滤取过滤液，用60%乙醇定容至50mL，得到10g/L样品溶液。1.3黄酮标准品溶液的配制称取芸香苷、槲皮素标准品各5mg，分别置于50mL容量瓶中，加适量无水乙醇将其完全溶解，纯水定容，得到0.1mg/mL芸香苷标准液、槲皮素标准液。1.4黄酮3种定量测定方法1.4.1直接测定法分别取大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，用紫外分光光计在300800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇作基线处理，记录吸光度。1.4.2三氯化铝法分别取1mL大血藤提取物溶液、芸香苷标准
6、液、槲皮素标准液，加入3支10mL具刻度试管中，依次加入1mL0.1mol/LAlCl3溶液及1mLpH值为5.5的醋酸钠-醋酸缓冲液，用60%乙醇定容至刻度，在300800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇同样显色后作扫描基线，记录吸光度。1.4.3亚硝酸钠-硝酸铝法分别取1mL大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，加入3支10mL具刻度试管中，加60%乙醇定容至5mL，加5%NaNO2溶液300L，静置6min后加入10%Al（NO3）3溶液300L，静置6min后再加入4mL1.0mol/LNaOH溶液，最后用60%乙醇定容至10mL，30水浴静置20min，在300800n
7、m波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇加显色剂管作扫描基线，记录吸光度。1.5亚硝酸钠-硝酸铝显色法考察根据以上3种方法的光谱扫描结果，筛选出合适的标准品为芸香苷，采用亚硝酸钠-硝酸铝法显色进行试验。1.5.1标准曲线绘制分别取芸香苷标准液0、1、2、3、4、5mL至6支10mL具刻度试管中，加60%乙醇稀释至5mL，按照“1.4.3”节的方法显色，在510nm波长处测定吸光度，以标准品质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。1.5.2精密度试验精确移取标准品液1mL，样品液1mL（5个平行样），按亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行操作，测定510nm波长处吸光度，计算样品相对标准偏差（RSD）。
8、1.5.3稳定性试验将芸香苷标准品及样品按亚硝酸钠-硝酸铝法操作，每隔10min于510nm波长处测定1次吸光度，共测60min，计算样品测定值相对标准偏差（RSD）。1.5.4重现性考察精确称取大血藤粉末4份，每份0.5g，按照“1.2”节方法制成大血藤提取液，按亚硝酸钠-硝酸铝法进行操作，于510nm波长处测定吸光度，计算4份大血藤提取物的总黄酮浓度，计算4份样品相对标准偏差（RSD）。1.5.5加标回收率试验用移液管精确移取5mL样品液置于烧杯中，加入60%乙醇溶液稀释至20mL，精确吸取1mL稀释后的样品液置于3支10mL具刻度试管中，按照亚硝酸钠-硝酸铝法于510nm波长处测定吸光度
9、，将吸光度代入标准曲线，求得1mL提取液中黄酮浓度，取平均值。另取4支干净试管，精密吸取1mL上述已测定黄酮浓度的样品液，分别加入1、2、3、4mL芸香苷标准液，按亚硝酸钠-硝酸铝法操作，于510nm波长处测定吸光度，计算加标回收率。endprint1.6DPPH自由基清除能力测定将大血藤样品母液分别配制成药材干质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1g/L的6个浓度梯度。取96孔酶标板，每6个测定孔为1组，依次加入不同浓度的大血藤提取物100L，然后选其中1组分别加入100L0.06mmol/LDPPH溶液，另外1组分别加入100L无水乙醇作为对照组，混匀，室温下放
10、置30min后，在全波长酶标仪中517nm波长下测定各孔的吸光度，加入DPPH组测定值为As，加入无水乙醇组测定值为At，同时设置100L60%乙醇加100LDPPH反应组，其吸光度作为空白对照Do，DPPH自由基清除率（I）计算公式如下。维生素C作为阳性对照。2结果与分析2.1光谱扫描结果由图1可知，芸香苷在368nm波长处、槲皮素在336nm波长处有最大吸收峰，样品在434nm波长处有较大吸收峰，在近300nm波长处吸光度达到最大，该区间与标准品没有很好地重叠，且大血藤提取物肉眼观察呈现红色，因此在紫外区-近紫外区吸光度较大，且紫外区测定易受蒽醌、酚类物质的干扰，该方法不适合大血藤黄酮的定
11、量测定。由图2可知，AlCl3显色体系中，槲皮素在430nm波长处、芸香苷在414nm波长处吸光度最大，大血藤样品在420nm波长附近并没有明显吸收峰，该方法不能用于大血藤黄酮的定量测定。由图3可知，在亚硝酸钠-硝酸铝显色体系中，芸香苷在510nm波长处吸光度最大，样品在502nm波长处吸光度最大，二者吻合度较高，槲皮素可见光区未观察到明显的吸收峰，所以本研究确定芸香苷为测定标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色方法，测定波长为510nm进行下一步试验。在该显色方法下，加入NaOH后，溶液中出现肉眼几乎难以察觉的细小悬浮物，长时间静置后变成沉淀析出，用滤纸将溶液过滤后进行测定，后续试验均需将测定溶液
12、静置20min后用滤纸过滤后测定。2.2标准曲线绘制芸香苷标准品溶液的线性回归方程为y=1.2354x+0.0015，r=0.9998，线性范围为00.5g/L。2.3精密度试验结果由表1可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为2.51%，样品溶液吸光度RSD为1.58%，精密度良好。2.4稳定性试验结果由表2可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为0.26%，样品溶液吸光度RSD为2.28%，说明在60min内吸光度稳定性好。2.5重现性试验结果重现性考察结果表明，4次平行提取大血藤提取物中黄酮含量分别为0.580、0.570、0.602、0.562g/L，平均值为0.5785g/L，RSD为2.9
13、9%，重现性好。2.6加标回收率试验结果稀释后大血藤样品黄酮平均含量为0.150mg/mL，加标回收率在97.7%101.0%，平均回收率为99.3%（表3），说明该法准确度高。2.7大血藤DPPH自由基清除能力由图4可知，随着大血藤提取物浓度和维生素C浓度的增大，DPPH自由基清除率均逐渐升高。3结论与讨论大血藤药材中黄酮种类较为复杂，有数十种10。目前，不同学者采用不同的方法对大血藤药材中总黄酮含量进行测定，有采用HPLC方法测定的8，有采用紫外法即低浓度氯化铝显色后在275nm处测定的7，有采用氯化铝显色后在420nm处测定的9，有采用亚硝酸钠-硝酸铝显色后在510nm处13测定的。本研
14、究结果表明，大血藤乙醇提取物AlCl3显色后在420nm附近并没有明显的光吸收峰，直接在紫外光范围内测定易受大血藤中蒽醌类、酚类化合物干扰，且对样品制备条件及机器性能要求比较高，二者不适合用于大血藤黄酮的比色法定量，因此笔者选择了亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行下一步试验。笔者在试验过程中发现，加入NaOH溶液后，会形成一些肉眼难以观察到的细小悬浮物，将溶液放置8h以上，在试管中能看到明显的沉淀物（同时进行的芸香苷标准液显色中未出现沉淀现象）。曾凡骏等用同样的方法测定银杏叶总黄酮时也观察到这种沉淀14。本试验将静置时间延长至20min，让原花色素类物质在碱性条件下充分沉淀，取滤纸过滤溶液用于测定，6
15、0min内吸光度稳定性很好。大血藤黄酮类化合物组成比较复杂，药材来源、提取工艺、测定方法、标准品选择等诸多因素对测定结果均有较大影响。本研究中基于分光光度计的亚硝酸钠-硝酸铝显色法的精密度、稳定性、重现性、线性关系、加标回收率均较高。DPPH在有机溶剂中是1种较稳定的自由基，在517nm波长处有强吸收，其结构中1个氮原子上有1个孤对电子，当自由基清除剂存在时，该孤对单电子被配对而导致其颜色变浅，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数呈化学剂量关系，因此DPPH被广泛用于检测自由基的清除情况以及评价样品的抗氧化能力。大血藤乙醇提取物具有很强的DPPH自由基清除能力。参考文献：1苗抗立，张建中，王飞音
16、，等.红藤化学成分的研究J.中草药，1995，26（4）：171-173，223.2倪士峰，傅承新，吴平.大血藤化学成分及药学研究进展J.中国野生植物资源，2004，23（4）：8-10.3毛水春，顾谦群，崔承彬，等.中药大血藤中酚类化学成分及其抗肿瘤活性J.中国药物化学杂志，2004，14（6）：326-330.4马瑞丽，于小凤，徐秀泉，等.大血藤的化学成分及药理作用研究进展J.中国野生植物资源，2012，31（6）：1-5.5ChangJ，CaseR.PhenolicglycosidesandiononeglycosidefromthestemofSargentodoxacuneataJ.Phytochemistry，2005，66（23）：2
