自从1996年LightCycler实时荧光定量PCR仪上市后，融解曲线分析就成为了实时PCR技 术的一个组成部分SYBR Green 1染料让研究者们不仅可以进行无需探针的定量，还可以 通过融解曲线分析的方式直接进行产物鉴定但是粕细的序列识别(如SNP基因分型)还是 需要标记探针用融解曲线分析进行SNP基因分型最初是用一条标记引物加上一条标记探针 完成的，后来发展为两条标记探针，每条都是单标记这些技术今天已经在普通实时定虽 PCR仪上得到了广泛应用现在，这一技术有了最新的进展可用于高分辨率融解曲线分析的新仪器和饱和双链DNA 结合染料讣研究者不用探针即可完成突变扫描和革因分型高分辨率融解曲线分析最初是用 标记引物来完成的(Gundry et al. , 2003),用于区分不同的杂合子和纯合子随后饱和 染料的引入让这类实验不再需要任何荧光标记的寡核廿酸(Wittwer et小.，2003)由于 无需进行产物分离，用融解1111线进行突变扫描天生就简单、便宜其检测杂合SNP的灵敏度 和特异性至少跟其他更为复杂的技术一样高(Reed and Wittwer, 2004, Chou et al. , 2005)。
高分辨率融解曲线分析的应用文献正在急剧增加目而最重要的一•类应用叫做基因扫描，即 不通过测序或在测序Z前，对PCR扩增片段中町能存在的未知突变进行搜索其原理就是检 测市于突变造成的DNA融解曲线形状变化要进行这种分析，除了上述的饱和双链DNA结合 染料外，还需要具备出色温度均一性的仪器以及精密的分析软件，才能从满天繁星般复杂的 数据中解读出特定序列“星朋”的信息通xl LightCycler 480实时荧光定量PCR系统平台上引入LightCycler 480 High Resolution Melting Master试剂和专川的分析软件，罗氏应川科学构建了第一个基于板式 实时定量PCR系统的基因扫描解决方案用高分辨率融解曲线法进行基因扫描的优点高分辨率融解1111线的特点是高特异性和高灵敏度，而且在人量样木的处理上，比传统的非均 —•性方法(如dHPLC)更方便、性价比更髙，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上 进行突变分析用高分辨率融解曲线分析可用一种染料对任何扩增子上的未知突变进行筛查，不再需要识别 不同等位形式的引物或探针，无论突变在扩增片段内的何处，均可检出LightCyclor 480基因扫描过程在LightCycler 480基因扫描实验中，样木DNA首先通过实时定量PCR反应进行扩增，体 系中含有特定的饱和双链DNA结合染料(如LightCycler 480 High Resolution Melting Master中含有的)。
LightCycler 480系统通过高频率的数据俘获生成融解曲线，最后使 用LightCycler 480基因担描软件模块完成数据分析LightCycler 480基因扫描软件模块就是专门开发出来进行高度精确的高分辨率融解曲线 分析的分析分3个基本步骤进行：信号的归一化处理，温度座标平移和差界作图100.09190.09180.09170.09160.09150.09140.09130.09120.09110.0910.0918485 86 87Temperature CO8813.534 -11.534 一9.534 -7.534 -5.5343.534 -1.534 —-0.466 一Normalized and teni|>eraUire-shifted difference plot85 86 87Temperature (C)图1：髙分辨率融解曲线分析揭示纯合样本与杂合样本差界a）扩增子为含有G - T突 变的人类红细胞内收蛋& alpha亚基基因ADD1 212 bp片段,来自96份不同的血液样本, 使用高分辨率融解染料b）差异图形分析可区分纯合样本（野生型或突变型，蓝色）与 杂合样本（红色）。
为什么要选用LightCycler 480基因打描平台？LightCycler 480系统是目前唯一将基于高分辨率融解曲线分析的基因扫描作为一个髙通量实时定量PCR整合解决方案提供给客八的平台，同时还包括友好、直观的软件和优化的反应预混液 硬件.软件和含有染料的高分辨率融解反应预混液均以完成研发上市，而且報个系统对基因 扫描应用进行了整体优化全部基因扫描实验可在同一台仪器上完成，样本量一次最髙可达384个，2小吋内完成所有实验和分析100.479-90.479 -80.479 -70.479 -60479 -50.479 _40.479 -30.479 —20.479 -10.479-11n i ri75 76 77 78 79 80Temperature CC)0 aouals-p _eu0s9.754 -4.754 --0246 -346 --10^46-Normalized and tern卩eralme-shifled difference plol75 76 77 78 79 80Tempflrature CO)图2:用扩增了高分辨率融解分析区分纯合了a）扩增子为含有G-T突变的人类LPLH30.479 一棊因163 bp片段，來自96份不同的血液样木，使用高分辨率融解染料。
b）差异图形分 析可区分野空型（绿色）、纯合突变型（红色）与杂合突变型（蓝色）参考文献1. Hoffman M et al. (2007) Biochemica 1:17 - 192. Hoffman M et al. (2007) Nature Methods Application Notes an!7 - an18 (www. nature・ com/app_notcs/nmoth/indox)3. Herrmann MG et al. (2006) Clin Chem 52:494 - 5034. Dujols V et al. High-resolution melting analysis for scanning and gcnotyping.,in Real Time PCR. Tovfik D, ed., Taylor and Francis, Abingdon, 20065. Rcischl U (2006) Clin Chem 52:1985 - 1987。