实验三 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳【实验目的】熟悉醋酸纤维薄膜电泳方法及其在分离血清蛋白中的应用，了解电泳技术的一般原理 【实验原理】醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样结构，厚度仅120 um,有强 渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白质电泳具有微量、快速、简便 及分辨率较高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定蛋白质是兼性离子由于组成蛋白质分子的氨基酸种类和数目不同，各种血清蛋白质 的分子量和等电点也不相同在同一条件下（电场强度、电渗、温度、缓冲液pH和离子强 度等），它们电泳速度各不相同，因而可以分离本实验以醋酸纤维薄膜为支持物，利用血 清中蛋白质颗粒的等电点大部分低于7,在缓冲液pH8.6中带负电荷，在电场中向正极移动, 电泳后根据血清蛋白移动快慢，可依次分为清蛋白、球蛋白的5、a 2、［3、丫五个区带， 染色后显出清晰色带由于各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比，可将各色带剪开, 分别溶于碱性溶液中，用分光光度法计算各种蛋白质的百分数，也可以将染色后的膜条直接 用光密度计测定实验试剂】1、 巴比妥缓冲液（pH8.6,离子强度0.075）:称取巴比妥钠15.45g,巴比妥2.76g,用蒸徭 水配成1000ml o2、 染色液：氨基黑10B0.25g,甲醇50ml,冰酷酸10mL蒸餾水40ml混合配制工作液（可 重复使用）。
3、 漂洗液：95%乙醇45份，冰酷酸5份，蒸徭水50份4、 0.4moL/LNaOH洗脱液：収4克NaOH加蒸傭水至250ml5、 透明液：冰醋酸25-30ml加95%乙醇70-75mL6、 新鲜无溶血血清实验器材】电泳仪（包括整流器与电泳槽）与分光光度计或光密度计、染色缸、醋酸纤维薄膜（2X 8cm）.点样器（宽1,5cm）. 10ml吸管、大试管等、培养皿、滤纸、银子、直尺、铅笔、剪 刀等实验操作】1、准备：（1）浸泡醋酸纤维薄膜：用蹑子取2X8cm醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光 泽而，并在角上用笔作上记号），在膜的粗而一端2cm处用铅笔轻划一横线，表示点样位置, 将膜浸入巴比妥缓冲液中充分浸透（约20分钟）2) 向电泳槽内倒入巴比妥缓冲液：将巴比妥缓冲液倒入电泳槽的两个电极槽内，槽 内的液面要等高3) 制备滤纸桥：取两层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对 齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内该滤纸条即为滤纸桥它是联系酷酸纤维薄膜和两极 缓冲液之间的桥梁2、 点样：取出浸泡好的醋酸纤维薄膜，将其夹在两层粗滤纸内吸去水分，膜的粗面朝 上平铺在玻璃板上将点样器浸入蒸憎水中沾湿用吸水纸吸十后再沾血清(改进)，紧印在 膜粗面点样线上使血清全部渗入膜内。
3、 电泳：将膜点样面向下，两端拉紧贴于电泳槽架的滤纸桥上，点样端靠近阴极，盖 上槽盖，静置平衡5・10分钟，待醋酸纤维薄膜全部润湿后通电调节电压方法1：电压 先90v, 10分钟；120 v ,电流0.4-0.7mA / cm宽，约45・60分钟关闭电源方法2：电压 先160v ,电流0.4・0.7mA/cm宽，约25分钟关闭电源若连续数次电泳，每次正负电极 应转换4、 染色与漂洗：电泳完毕，取出膜条，直接浸入氨基黑10B染色液中，染色3・5分钟 取出薄膜，立即浸入漂洗液中，时时漂盈，漂洗3・4次至背景无色为止，用蒸饰水冲洗后放 室温凉干或放100C以下干燥箱烘干则得色带清晰的电泳图谱5、 定量：将漂净的膜条上各蛋白色带剪下，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条作空 白对照将各类膜条分别加入6支大试管中，清蛋白中力U0.4moL/LNaOH6ml (为其它试管 体积的2倍)，其余各加3ml,吋时摇动，置37C水浴10分钟，使其色泽浸出(注：试管 内加入的NaOH溶液根据蛋白质区带染色深浅而泄)用分光光度讣650nm波长进行测泄， 读取各管的光密度(0D)o如果样本须保留，可将干燥的图谱膜条放入透明液中浸泡2〜3分 钟后取出平贴于干净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱。
放40C温水浸泡5分钟可揭起 膜吸干保存或用光密度计直接测定6、 计算OD 总和 T=OD (A) X2+OD ( a 丨)+OD ( a 2)+ OD ( B ) + OD ( 丫)清蛋白%=2XOD (A) /TX100%a 】球蛋白%= OD ( a J /TX100%a 2球蛋白%= OD( a 2)/TX100%P 球蛋白=% OD ( P ) //TX 100%Y 球蛋白%=OD ( Y)TX100%【说明】1、醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白正常值：清蛋白(A)： 55-74%, a i球蛋白2-5%, a2 球蛋白4・9%, B球蛋白6.5 — 12%, Y球蛋白12-20%，肝硬化时清蛋白显著降低，丫球 蛋白升高2・3倍，肾病综合征时清蛋白质降低，a 2、B球蛋白升高2、电压电流、电泳时间、血清加量、醋纤膜质量、染料质量和浓度、染色时间和染料应 用的次数，漂洗的次数及每次间隔的时间、缓冲液的离子强度、透明液的醋酸浓度等都对影 响醋纤膜电泳分析的结果因此在实验中要注意以下几个问题：（1） 醋纤薄膜质量、膜处理和点样技术是避免电泳图谱不齐或分离不良的关键① 要选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。
然后将 滤纸吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量饱和均匀，以防薄膜表面液体含量不均，水份 移动而引起标木移位② 点样前注意关闭门窗和风扇，以防由空气流通快使标本和水份蒸发而影响电泳图形③ 点样前耍先将点样器浸入蒸憾水中沾湿用吸水纸吸干后再沾血清④ 点样时血清滴加要均匀迅速，不能滴加过多2） 点样后薄膜不能过干，电泳槽密封要严，电流、温度要适宜是避免电泳图谱出现条 痕的关键① 点样前薄膜一定要充分浸透② 电泳前要注意检查电泳槽是否盖紧③ 电泳槽耍放在远离光源热源的阴凉之处防止温度过高④ 电泳过程中要随时观察电压电流的变化，因通电后产生一定的热量，电流会冇所增 加控制电压100〜110V,电流0.5〜0.6mA/cm⑤ 电泳吋间一般冬长夏短，以区带展开3.5〜4cm即可（另加一条漠酚蓝预染血清，同 样操作，指示区带展开的距离）3） 适宜的缓冲液离子强度、适量的薄膜数量是避免区带拖尾或区带过于紧密的关键① 要及时检查缓冲液的离子强度缓冲液的离子强度低于0.05即出现区带拖尾现 彖，离子强度＞0.075则区带过于紧密此时需要检查更换缓冲液常规操作一般使用连续 电泳巴比妥盐缓冲液pH8.6,离子强度0.06o② 电泳槽中缓冲液经10次使用后，不应简单地采取交换电极的方法，而是将缓冲液取 出重新混合过滤后，再进行使用，一般用4个周期后需更换新液。
离子强度愈低，区带展开 愈长，电泳速度愈快③ 实验中发现薄膜愈少，展开的距离愈短，区带愈清晰因为在仪器输出电压相同的情 况下，薄膜愈少，加在薄膜两端的电压愈高，电压高会使展开的长度缩短薄膜数量在5 条左右，即可使图谱展开长度有较好的重现性4）薄膜要紧压在电泳槽的滤纸桥上，避免区带一边长一边短呈现扭曲现象这是薄膜两边电阻不一样，电阻大的一边电流小，速度慢，区带展开短造成这种现象 的原因是薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻在操作过程中， 一定要注意使薄膜两端紧压在滤纸桥上5） 丫球蛋白区带倒退这是电渗作用引起的对升高点样端的缓冲液面高度或适当加大电流量克服之6）染色时间过短或点样量过多会造成染色后白蛋白中间色浅，可增加染色时间或减少 点样量解决之7） 标本溶血会造成染色后区带清晰度不良陈旧标本可使区带分离清晰度大为降低应尽量当日标本当日做，最多不超过2天 另外标本不可溶血，因溶血标本中血红蛋白与卩球蛋白的电泳区带相重迭可造成卩球蛋白 含量升高而蛋白质含量相对减少的结果8） 染色液陈IH会使白蛋白区带染色不均并有空泡这是染色液陈IH所致，染色液存放和使用过久，会降低蛋白质结合染料的能力。
发现正 在使用的染液已陈I口时，应立即全部弃去，更换新液9） 透明时膜发白不能完全透明薄膜未干或透明液中醋酸含量不足可造成膜发白而不能达到透明的目的，应将薄膜晾 干，适当增加透明液的醋酸浓度10）透明时膜溶解室内温度过高或透明液醋酸浓度过高均对使膜溶解＞ 可采用适当降低透明液醋酸浓度的 办法来解决3、醋酸纤维薄膜电泳点样为什么在粗糙面？醋酸纤维素薄膜木身就像包装药片的铝塑纸一样，它是由一层薄薄的聚乙烯和压附在其 上的醋酸纤维素酯构成的光滑一面是聚乙烯一面，唯有粗糙面是酷酸纤维素酯的一侧所 以自然要点在粗糙面上了。