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1、 烟草SMC1A基因克隆、表达载体构建及表达分析 卢健荣摘 要：采用同源克隆的方法对烟草品种K326中的一个SMC1A基因进行了研究，组织表达分析发现，该基因在成熟期的根、茎、叶、花中均有表达，在根中的表达量最高。有研究表明，该基因的稳定表达对低钾、高盐、干旱、ABA均有响应表达，试验成功构建了pET32a-SMC1A过表达载体。研究结果能为解析SMC1A在响应逆境胁迫的功能奠定一定理论基础.关键词：烟草SMC1A 克隆 生物信息学 基因表达染色体结构维持蛋白（SMC蛋白，structural maintenance of chromosome proteins），与染色体结构细胞周期性的动态
2、变化紧密相关，它们参与有丝分裂染色体的集缩和分离、性染色体的剂量补偿效应、姐妹染色单体的内聚作用、遗传重组和DNA修复等过程1，具有一定的结构保守性，可作用于染色体代谢的多个方面。SMC蛋白普遍存在于各种生物中，尽管不同种类SMC蛋白的结构有差异，但是它们具有一定的保守性2。通常，SMC蛋白是由1000到1500个氨基酸残基组成的多肽并具有共同的结构特征：N端核苷结合基序，中间两个被铰链隔开的螺旋区（可能与蛋白质之间的相互作用有關），C端被命名为DA盒的保守序列。DA盒与ATP酶的特征基序非常相似，DA盒和N端ATP结合区共同组成ATP酶功能域，因此SMC蛋白是一类染色体ATP酶。许多原核生物
3、（包括细菌、古细菌）也具有编码SMC蛋白的基因。革兰氏阳性细菌枯草杆菌SMC基因的突变会导致无类核细胞的形成、类核结构的破坏以及与染色质分离相关的蛋白复合物的错误组装，这说明枯草杆菌的SMC基因产物与类核物质的压缩直接相关35。SMC蛋白与染色体行为密切相关，它与不同亚基结合在多个方面影响染色体，本实验拟通过克隆烟草SMC1A基因，分析进行其遗传特性学及其生物信息学特性分析，为研究烟草基因组稳定性奠定基础。1 材料与方法1.1材料烟草品种K326；原核表达载体pET-32a（+）；rans5化学感受态细胞和BL21（DE3）化学感受态细胞（购自北京全式金生物技术有限公司）；T4 DNA Lig
4、ase、EcoR I-HF?和Not I-HF?限制性核酸内切酶（New England Biolabs（NEB）公司 ）；胶回收试剂盒和质粒小提中量试剂盒 （天根生化科技（北京）有限公司）1.2方法1.2.1 SMC1A基因引物设计与合成参考NCBI GenBank基因库中SMC1A（NM_019710.2）基因序列设计引物，引物设计如下：MC1A-F：ATGGGTTTCCTGAAACTGATMC1A-R：GCTATTGTTCATTGGGGTTGG所设计引物送生物公司进行合成。取烟草品种K326叶子，提取总RNA，进行反转录PCR（reverse transcription-PCR， RT-
5、PCR），转录成cDNA，保存于-80冰箱。通过PCR扩增其基因，克隆至质粒载体，对克隆得到的编码基因进行PCR鉴定及测序鉴定。具体体系和反应条件如表1所示。反转录成cDNA后，参照2TransTaq High Fidelity（HiFi） PCR SuperMix 说明书的体系要求分别加入试剂，具体试剂参见表2所示。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。条带正确则将目的位置PCR产物电泳条带胶回收纯化，胶回收方法具体操作参考天根胶回收试剂盒说明书进行。1.2.2重组质粒的构建及鉴定1.2.2.1 目的基因与表达载体连接将转有原核表达载体pET-32a（+）的细菌过夜培养，提取pET-3
6、2a（+）载体质粒，提取方法见说明书。取pET-32a（+）质粒和纯化后的PCR产物，分别加入预先准备好的EcoR I-HF?和Not I-HF?限制性内切酶进行双酶切，反应条件为37 4 h，65 15 min，具体体系和反应条件参考表3和表4。反应结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳，并参考天根胶回收试剂盒对产物进行纯化，具体操作参考说明书进行。回收后的样品按摩尔比，载体：插入的DNA=1：7的比例加入，并添加1L T4 DNA Ligase和2L 10buffer，1L Nuclease-Free Water，总体系为20L。置于4过夜反应。1.2.2.2 转化反应结束后，向反应液中加入50
7、 L Trans5化学感受态细胞，反应条件为冰浴2030 min，42热激1 min 30 s，冰浴2 min，然后加入200 L无氨苄青霉素LB液体培养基，于摇床上37 ，200 rpm培养1-2 h，再将菌液涂布于含氨苄青霉素LB固体培养基上，置于37 培养箱中过夜培养。第二天进行阳性菌的筛选。1.2.2.3 重组质粒的PCR鉴定阳性菌落的筛选，首先进行PCR鉴定，将SMC1A基因和载体T7引物进行组合，分别是SMC1A上游引物SMC1A- F与SMC1A下游引物SMC1A-R、载体上游引物T7 F与载体下游引物T7 R、SMC1A上游引物SMC1A-F与载体下游引物T7 R和SMC1A下
8、游引物SMC1A-R与载体上游引物T7 F等四种组合方式。1.2.2.4 重组质粒的酶切鉴定及测序结果分析鉴定正确后，将菌液加入到含氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养。培养完成后，将菌液分成两部分，一部分菌液按1：1的比例加入60%的甘油用于保种，一部分菌液提取质粒，进行酶切鉴定和测序鉴定。测序结果先进行NCBI GenBank库比对，确定其正确性，然后利用软件DNAMAN翻译成氨基酸序列，再进行生物信息学分析。2 结果与分析2.1 PCR扩增结果PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，如图1结果显示，在第1泳道750bp和1000bp间有一清晰条带，大小与预测大小一致，说明该对引物可特异性扩增出目的
9、基因。2.2 重组质粒PCR鉴定结果挑取培养板上的菌落进行PCR鉴定，PCR产物电泳结果如图2所示，表明在两对引物的组合扩增下，所选菌落在预测位置分别出现相应的PCR片段，说明目的基因插入到表达载体的相应位置。2.3 重组质粒酶切鉴定结果重组质粒在双酶切消化反应后，经琼脂糖凝胶电泳可见，EcoR I-HF?和Not I-HF?酶切的1泳道中出现两条条带，一条大概为820 bp左右与SMC1A基因擴增大小一致，另一条大小大概5789 bp是载体酶切后的片段；在两个酶分别单酶切消化反应的泳道2和3中，均只出现一个条带，大小约为6691 bp；在无酶切消化反应的泳道4中，由于质粒的特殊结构，一般出现
10、二到三个条带，结果如图3所示。以上结果初步说明含有目的基因的重组质粒构建成功。2.4 重组质粒测序鉴定及基因生物信息学分析对测序结果进行分析，根据酶切位点位置，将其中的目的基因挑出，基因片段大小为810bp，基因序列如图4所示，并与NCBI GenBank在线比对分析。建立遗传进化树，由同源性分析发现，克隆的SMC1A基因与ZJ99株及MW9710株的同源较高，结果如图5所示，说明本实验成功克隆SMC1A基因，序列已上传至NCBI GenBank（ID： KX831117.1）。3讨论本实验通过查找基因库，初步克隆烟草品种K326中的SMC1A基因，成功克隆SMC1A基因，并分析得到其遗传特性
11、及其遗传进化树。对其抗原表位、信号肽、跨膜区域、糖基化位点及磷酸化位点等生物信息学特性有一定的了解。相关研究表明，SMC1A基因的稳定表达对低钾、高盐、干旱、ABA均有响应表达，实验成功构建出pET32a-SMC1A表达载体，能为解析SMC1A在响应逆境胁迫的功能奠定一定理论基础。参考文献：1 Diebold-Durand ML，Lee H，Ruiz Avila LB et al.Structure of Full-Length SMC and Rearrangements Required for Chromosome OrganizationJ.Mol Cell，2017，67（2）：33
12、4-347.2 彭莉，张飞雄.SMC蛋白的结构和功能J.遗传，2001，23（2）：173-176.3 Hirno T，T J Mitchison. A heterodimeric coiled-coil protein required for mitotic chromosome eondensation in vitroJ.Cell，1979：449-459.4 Chuang P T，Albertson D G，Meyer B J.DPY-27：A chromosome condensation protein homolog that regulates C.elegams dosage compensation through association with the X chromosomeJ.Cel1.1994，79：459-474.5 Uhlmana F，Nasmyth K.Cobesion between sister chromasides must be establisbed during DNA replicationJ Curr Bio1.1998，8：1095-1l0l. -全文完-
