专题2微生物的培养与应用课题1微生物的实验室培养防治杂菌入侵，获得纯净的培养物,是研究和应用微牛物的前提在实验室培养微生物，一方面需要为微生物提供合适的营养和环境条件（配置培养棊，置于适宜条件 下培养）；另一方面需要确保无处不在的英他微生物无法混入（无菌操作）基础知识】一、培养基1. 概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质叫培养基2. 分类标准培养基类型配制特点主要应用物 理 性 质固体培养基加入琼脂较多菌种分离，鉴定，计数半固体培养基加入琼脂较少菌种保藏液体培养基不加入琼脂工业生产, 连续培养化学 成 分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确分类鉴定目 的 用 途鉴别培养基添加某种指示剂或化学药剂菌种的鉴别选择培养基添加（或缺少）某种化学成分菌种的分离3. 营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质） 和无机盐，此外还要满足微生物生长对凶、特殊营养物质以及氧气的耍求4. 培养乳酸杆菌时需在培养皐中添加维生素、培养霉菌时需将培养基pH调至酸性、培养细菌时需将 PH调至中性或微碱性、培养厌氧微生物则需提供无氧条件（密封培养）。
［拓展提示］① 琼脂的作用：作为凝固剂，98C溶化，44C以下凝固；② 自养型微生物可直接利用C02作为碳源，而异养型生物则不能；③ 葡萄糖作为碳源，进入细菌体内主要作用：为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原 料；④ 培养基中若含有KH2PO4和NazHPCh,其作用有为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过 程中pH稳定无菌技术1•无菌操作获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，具体操作 如下：⑴对实验操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌⑶为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触2.消毒和灭菌（1）概念：消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽 砲和砲子）O灭菌是指用强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物,包括•芽也和也子2）方法灭菌或消毒种类主要方法应用范围灼烧灭菌酒精灯火焰灼烧接种环、接种针及试管口等干热灭菌干热灭菌箱内，在160〜170 C下加热1〜2h玻璃器皿、金属用具等高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌锅内，100kPa, 121 C下持续加热15〜30 min培养基等紫外线消毒30 W紫外线灯照射30min接种室空气等化学药物消毒用体积分数为70%〜75% 的乙醇、碘酒涂抹等用于皮肤、伤口、动植物组织表面消 毒，手术器械、玻璃器皿等消毒巴氏消毒70〜75 C下煮 30 min牛奶、啤酒等一些不耐高温的液体【实验操作】----大肠杆菌的纯化培养本实验所用的培养基是牛肉膏蛋白腺培养基（注意不要写错别字），本实验可分成 制备培养基和纯化大肠杆菌两个阶段进行。
一.制备牛肉膏蛋白腺固体培养基1.制备牛肉膏蛋白腺固体培养基计算一T称量一T溶化一T灭菌一T倒平板调pH应在灭菌Z前）2.倒平板：待培养基冷却至50C左右时在酒精灯火焰附近操作进行［思考］锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是什么？提示：灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基［思考］平板冷凝后，为什么要将平板倒置培养？提示：既可以防止皿盖上的冷凝水滴落污染培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发［思考］若倒平板过程中，不小心将培养基溅在皿盖和皿底之间，则该平板能否培养微生物？为什么？ 提示：空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间滋生，因此最好不要用这个平板养微生物二、纯化大肠杆菌（分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即单个菌落微生物接种：最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法另外还有穿刺接种和斜面接种等虽然这 些技术的操作方法各不相同，但是，其核心都是要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度1. 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表血连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到 培养基的表面行线，盖其操作步骤是：①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至接种环烧红② 在酒精灯火焰旁冷却接种坏，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。
③ 将菌种试管口通过火焰④ 将冷却的接种坏伸入到菌液中,沾取一坏菌液⑤ 将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞⑥ 将皿盖打开一条缝隙，把接种环迅速伸入平板内，划三至五条平 上皿盖，不要划破培养基⑦ 灼烧接种环，冷却后从第•区域划线的末端开始往第二区域内划线重复上述过程，完成三、四、 五区域内划线注意不要将最后一区的划线与第一区相连⑧ 将平板倒置，放入培养箱中培养［思考］为什么在操作的第一步及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍需要灼烧接种环吗？为什么？提示：（1）平板划线操作的第一步之前要灼烧接种环，目的是为了避免接种环上可能存在的 微生物污染培养基；（2） 平板划线除首次划线外，每次划线前都要灼烧接种环，目的是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种；（3） 平板划线结束吋要灼烧接种环，其目的是避免接种环上残留的菌种污染环境和感染操作者.［思考］在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后在进行划线？提示：以免接种环温度太高，杀死菌种［思考］在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？提示：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少每次从上一次划线的末端开始，能使 细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而成的菌落。
2. 稀释涂布平板法则是将菌液进行-系列的梯度稀释,然后使用涂布器将不同稀释度的菌液分别涂 布在琼脂固体培养基表面进行培养在稀释倍数足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细 胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落1）系列稀释操作（应在酒精灯火焰附近进行）：② 用灭菌后的移液管（无菌移液管）吸取ImL菌液注入编号为10】试管中，并吹打3次使Z混匀获得IO?倍稀8-10So③ 从10】倍液中吸取imL菌液注入到编号为试管内吹打均匀, 释液依此类推2）涂布平板操作① 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中② 収少量菌液（不超过0.1ml）,滴加到培养基表面③ 将沾有少量洒精的涂布器在火焰上引燃，待洒精燃尽后，冷却④ 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基的表面涂布吋可转动培养皿，使菌液分布均匀 注意：若将涂布器用酒精灯火焰烧至通红，目的是灭菌，防止涂布器上杂菌污染取菌液接种至培养基的量不宜过多，否则会造成菌液堆积，无法形成单个菌落［思考］稀释涂布平板法的所有操作都应在火焰附近进行结合平板划线法与系列稀释的无菌操作要 求，想一想，第二步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证“无菌”例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要 接触任何其他物体，吸管要在酒精灯火焰周围等。
［思考］接种方法的比较及分析① 平板划线法：操作简单，但是单菌落不易分离稀释涂布平板法：操作复杂，但是单菌落易分离② 平板划线法不能用于计数：首先，划线法用到的菌液体积无法计算；其次，划线法得到的许多菌落 重叠在一起，无法计数稀释涂布平板法可以用于计数，统计样品中菌落的数目往往比实际数目低 这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落3）培养将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37C恒温箱中,培养，12 h和24 h后，分别观察、 记录［思考］为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养？提示:培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1〜2 d后无菌落生长, 说明培养基的制备是成功的若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染 了，需要重新制备三.课题成果评价1. 培养基的制作是否合格（将未接种的培养基在恒温箱中培养一段时间，检测培养基是否灭菌彻底） 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1〜2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备2. 接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操 作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析 原因，再次练习。
四.菌种保藏1. 频繁使用的菌种，采用临时保藏的方法将菌种接种到固体斜面培养基上,在合适的温度下培养，当菌 落长成后，将试管放入些冰箱中保藏每3・6个月，都需从旧培养基转移到新培养基上缺点：保存的 时间不长，菌种容易被污染或产生变异2. 需长期保存的菌种，采用甘油管藏法将菌液和无菌甘油等量充分混合后，放在・20C的冷冻箱中保存。