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1、兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养体会摘要：骨关节炎(osteoarthritis, 0A)是一种 以关节软骨进行性退变病变慢性疾病，近些年发病率在不断 增高。基础研究主要有各种原因引起的细胞数量过少而无法 开展下去。在建立动物模型的基础上更有效的提取软骨细 胞、体外培养对基础研究做出最基本铺垫，为临床治疗提供 更有效的理论依据。本文通过软骨的提取、软骨的消化、细 胞的收集、培养、鉴定，结合国内外文献做一综述。关键词：骨关节炎；软骨细胞；体外培养软骨组织(cartilage)由软骨细胞(chondrocyte)和 细胞外基质(extracellularmatrix, ECM )构成，软骨细 胞是关节
2、软骨主要构成成分，主要功能是合成、分泌软骨基 质，维持软骨组织新陈代谢，是软骨破坏过程中的靶细胞， 因此软骨细胞的体外培养是研究关节软骨生理及病理的常 用体外实验模型，尤其是骨关节炎软骨细胞的提取在研究治 疗骨关节炎、最基本最关键的一步1。自从1967年 Manning 2采用胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法获得了 高纯度的软骨细胞以来，为了获得数量较多的软骨细胞，软 骨细胞的提取、培养、传代、鉴定，等不断改进。但不同的 动物，不同的模型对软骨细胞的提取也有一定的不同。本文 通过对兔膝骨关节炎造模成功后提取软骨细胞进行培养、传 代、鉴定进一步认识兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养的要点 及关键问题等。
3、1软骨的提取将实验兔用空气栓塞法处死，沿右膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约6 cmX6 cm的区域，浸泡于75%的酒精中2030 min,放入超净台中打开膝关节腔,无菌条件下用11号刀片(带柄)削取膝关节股骨課和胫骨 平台软骨组织，将获得关节软骨组织，置入盛有含青霉素钠 /链霉素双抗液(1X1010U/L)的D-hanks液的无菌平皿中, 用含双抗液(1X109U/L)的D-hanks液10 mL漂洗3遍,用眼科剪将软骨组织剪成lmm3小块，见图1,然后再用含双 抗液(1X109U/L)的 D-hanks 液 10 mL 漂洗 3 遍。在软骨的提取过程中首先必须在无菌的条件下打
4、开关节削取软骨，我们总会最大量的削取更多的软骨使得提取更 多软骨细胞，但更要主要的是避免削取软骨以外的组织， 避免细胞提取还有其他组织细胞；削取软骨时不要削的太 厚，可以一层层的削，这样可以有助于软骨的消化；削取 完后软骨组织必须剪成1 m3小块，有助于软骨的消化，用 缓冲液多清洗几遍更好地去除血液、脂肪组织等其他组织。2软骨的消化用0. 25%胰蛋白酶先消化3035 min,用含双抗液(1X109U/L)的 D-hanks 液 10 mL 漂洗 3 遍；加入 0. 2%II 型胶原酶(DMEM配制)，置于37C,体积分数5%C02培养箱 中培养消化100 min,每30 min置37C恒温振
5、荡箱振荡5 min。 后抽取上清液用200目不锈钢筛网过滤入离心管，800 r/min 离心4min弃上清，用含双抗液(1X109U/L)的D-hanks液 洗两遍每次800 r/min离心4rniri弃上清去除胶原酶。加入 含12%胎牛血清DMEM 3 mLo用枪轻轻吹打可获得单个软骨 细胞悬液。将软骨细胞按1X105/L浓度接种于10 mL培养 皿中，置于37C,体积分数5%C02培养箱中培养。培养皿中 剩余的软骨加入1%II型胶原酶(DMEM配制)置于37C,体 积分数5%C02培养箱中培养消化，每lh置379恒温振荡箱 振荡5 min。倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后， 用200
6、目不锈钢筛网过滤入离心管，800 r/min离心4 min 弃上清，用含双抗液(1X109U/L)的D-hanks液洗2遍800 r/min/次，离心4 min弃上清去除胶原酶。加入含12%胎牛 血清DMEM 3 mLo用枪轻轻吹打可获得单个软骨细胞悬液。将软骨细胞按1X105/L浓度接种于10 mL培养皿中，置于 37工，体积分数5%C02培养箱中培养。待细胞贴壁达到85% 90%后传代。很多文献中软骨细胞消化都在36h,然而软骨细胞的 消化时间要大大缩短，这也是兔膝骨关节炎模型的一个弊 端，因为兔子的软骨细胞消化时间过长越长细胞损伤越厉 害，虽然有时我们在细胞计数时看到的都是活细胞，但放到
7、 培养瓶里样上两天基本上没有贴壁的，软骨细胞也是一种群 居生活的物种，贴壁细胞越少增值能力越低。3细胞的传代及培养软骨细胞培养方法很多，包括单层培养法、三维培养法、 离心管培养法、生物反应器等。其中单层培养法、三维培养 法用的比较多，因三维培养法需要付出昂贵的费用本实验采 用单层培养法来培养兔膝骨关节炎软骨细胞。软骨细胞呈贴 壁生长后，随传代次数增加，软骨细胞发生去分化现象，限 制了软骨细胞的大量扩增。其中应该注意的是提取软骨细胞 时应用含12%13%FBS培养基进行培养，从第二代细胞开始 改用含10%FBS培养基进行培养，每3 d换液1次，细胞融 合并覆盖瓶底80%时，用0. 25%胰蛋白酶
8、（含0. 02%EDTA ） 消化，进行传代培养。主要是因为开始时用含12%13%FBS 培养基进行培养是因为可以使细胞更容易贴壁，而后改为含 10% FBS培养基进行培养是为了防止细胞早期就会出现”去 分化”现象。实验一般选用第三第四代细胞，其活性与增值 能力最强。细胞传代时应注意的是胰蛋白酶消化时间不要过程，室 温一般3060 s或用0. 1%的胰蛋白酶。尽可能的减少细胞 的损失。细胞离心600转5 min,用枪吹打细胞时用力不要 过猛。传代后细胞损伤严重时主要表现是细胞增值能力下降 或出现”去分化”现象，细胞的”去分化”现象主要表现在 细胞的形态与分泌，细胞从多呈三角形、长梭形或多角形向
9、 圆形改变，分泌的II型胶原以及蛋白多糖减少。5细胞的鉴定5. 1软骨细胞形态学观察在倒置显微镜下观察，刚接种 的软骨细胞呈球形，2448 h后开始贴壁生长，细胞多呈三 角形、长梭形或多角形，72 h后细胞开始增殖，单层生长， 彼此不相接触。细胞增长至爬满瓶底时软骨细胞可变为圆 形，胞体丰满，胞浆均匀，核大而圆并且互相连接成”铺路 石”样结构。苏木精-伊红染色苏木精-伊红染色可见软骨细 胞呈三角形或多角形，细胞核呈紫蓝色，可见明显的双核仁 或多核仁形态，细胞基质红染，胞浆及细胞周围有紫红色或 红色异染出现3。5. 2II型胶原蛋白II型胶原的合成和分泌是软骨细胞维持其分化表型的特征性指标，可通
10、过 II型胶原免疫荧光染色及II型胶原免疫组化染色来鉴定。II 型胶原免疫荧光染色(异硫氧酸荧光素FITC )可见胞浆和 胞膜呈清晰绿色荧光，细胞核区域未见明显绿色荧光，证明 软骨细胞特征性II型胶原主要分布在胞浆和细胞膜上。II型 胶原免疫组化染色可见软骨细胞胞浆被染成棕黄色，胞核不 着色，胞外基质中也有棕黄色颗粒出现4。5. 3蛋白聚糖蛋白聚糖是软骨细胞分泌的基质成分，是 软骨细胞功能的主要指标，可通过甲苯胺兰染色和阿利新蓝 (Alcianblue )染色进行鉴定。甲苯胺兰染色可见软骨细胞 呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色，软骨细胞内及细胞周围有蓝紫 色异染颗粒；阿利新蓝染色可见软骨细胞胞浆和胞膜
11、呈深蓝 色，证明培养软骨细胞分泌和合成蛋白聚糖5。5.4 IL-1, TNF-a、MMP-13在细胞内以及分泌表达在 ELRSA试剂盒。6展望软骨是一种特殊类型的结缔组织，由软骨细胞、软骨基 质和纤维构成。软骨细胞的功能为合成细胞外基质大分子及 各种酶类，而软骨细胞外基质主要有胶原和蛋白多糖聚集体 组成。胶原中有间质型胶原I、II和III,且II型胶原为软骨 细胞的基因表达产物可用来确定软骨细胞的表型6。1965年Chesterman和Smith首次利用体外培养的软骨 细胞修复松质骨和关节软骨缺损，近30年来软骨细胞体外 培养在方法学上也取得了很大进展7。软骨细胞经过培养 所形成的结节样结构，
12、具有关节软骨的生物学特征。软骨细 胞体外培养的方法是从细胞水平来探索关节软骨生物学特 性，为研究关节软骨疾病的发病原理及其治疗方法（包括药 物治疗）提供了有效而简便的方法。以细胞体外培养技术为 基础，在体外将软骨细胞进行定向诱导分化，调节细胞的增 殖及凋亡等方面的研究，有助于研究治疗某些退行性疾病的 药物，因此具有广阔的应用前景。因骨性关节炎软骨细胞处于退变期，细胞周期较正常软 骨细胞周期要短，其可能原因：骨性关节炎软骨细胞为变 性软骨细胞，细胞功能的改变可能影响细胞周期的变化8。 损伤的骨性关节炎软骨中，软骨细胞代谢活跃，相伴随的细 胞分泌的各种胞外基质也相应高表达，软骨代谢的异常，导 致胞
13、外基质成分的异常，软骨细胞生存环境改变促使软骨细 胞过早的死亡，加剧骨性关节炎的进程；骨性关节炎软骨细 胞中混杂有纤维软骨细胞，纤维软骨细胞增殖速度明显较软 骨细胞快，必将影响细胞周期的变化9-10 o体外培养软骨细胞是研究软骨分化、增殖以及软骨病变 的一种常用模型，也是软骨组织工程的基础。目前体外软骨 细胞的培养技术已经日渐成熟，可从许多动物及人的不同软 骨组织中分离培养软骨细胞，但是软骨细胞的体外培养方法 均存在一定的局限性，培养条件还有待进一步完善。另外， 软骨细胞分化、增殖过程中受到多种调控因子的调控，其相 互作用机制复杂，对软骨细胞体外培养的影响还有待进一步 的深入研究。参考文献：1
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