www.yitaD论文发表专家组蛋白H2A衍生抗菌肽的重组表达及活性分析【摘要】：口前，由于食品生产、农业生产和医药卫生等领域中抗生素 的广泛使用,造成病原菌耐药性的提高以及抗生素残留等诸多危及人 类健康的问题因此，目前人们急需寻找一种高效、广谱、安全的新 型抗菌剂替代传统抗生素由于抗菌肽独特的抗菌机制，不易使病原 菌产生耐药性，具有广谱的抗菌活性等优点，它在治疗学领域，畜牧业, 食品防腐剂等己被用来作为新一代的抗微生物剂已报道的抗菌肽超 过2000种,这些抗菌肽携带净正电荷并且大多数倾向于形成两亲的a- 螺旋结构组蛋白衍生的抗菌肽(histone-derivedantimicrobialpeptides,) 是组蛋白在某种机制作用下被降解、修饰和分泌出的一种小分子多 肽基于HDAPs具有体外抗菌活性，本研究在对四膜虫及人类组蛋白 H2A分析的基础上，通过基因工程技术，构建四膜虫及人类组蛋白H2A 衍工的抗菌肽的高效融合表达载体，在大肠杆菌表达系统成功实现四 膜 虫 组 蛋 白 H2A 衍 生 抗 菌 肽 (Tetrahymenathermophilahistone-derivedantimicrobialpeptides,ThAP)和 人 类 蛋 口 H2A 衍 生 抗 菌 肽 (Humanhistone-derivedantimicrobialpeptides,HhAP)的重组表达，对重组 蛋白的抑菌活性进行研究，实验结果如下：(l)ThAP和HhAP基因的设 计合成根据四膜虫及人类组蛋白H2A序列，设计H2A衍生的 HDAPs:ThAP和HhAP肽序列，利用大肠杆菌偏爱密码子表，合成在大 肠杆菌中高效表达的组蛋白衍生物抗菌肽基因片段ThAP和HhAP,并个易战抿再E _ 论文发表专家 构建于克隆载体PUC57上⑵ThAP和HhAP生物信息学分析通过抗 菌肽数据库网站及SOPMA程序分析了 ThAP和HhAP氨基酸残 基的分子量大小、净电荷数、两亲性、等电点、二级结构及三级结构 等，预测结果显示：ThAP和HhAP蛋白质分子量分别为 2.15KD.2.22KD:ThAP主要由a螺旋结构组成，占57.89%,HhAP主要由 a螺旋(43%)和无规卷曲结构(38%)组成。
3)重组表达质粒的构建及 GST-ThAP和GST-HhAP的表达及纯化将重组质粒pUC57-ThAP和 pUC57-HhAP用BamHI和Xholl双酶切，冃的基因与表达载体 pGEX-4T-l 连接，获得 pGEX-4T-l-ThAP 和 pGEX-4T-l-HhAP 重组表达 质粒重组质粒分别转化至人肠杆菌BL21株中，获得重组工程菌株 BL21/pGEX-4T-l-ThAP 和 BL21/pGEX-4T-l-HhAP.0」mMIPTG,37C 诱导4h,GST-ThAP和GST-HhAP表达,GST琼脂糖亲合层析柱分离纯 化得到融合蛋白 GST-ThAP和 GST-HhAPo(4)GST-ThAP 和 GST-HhAP 活性检测GST-ThAP(ThAP)/GST-HhAP对革兰氏阴性细菌大肠杆菌 (DH5a)和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的抑菌活性结果显示:融合 蛋白GST-ThAP和GST-HhAP对G+和G・细菌均有抑制作用,融合蛋 白GST-ThAP比GST-HhAP对DH5a抑制作用明显；GST-HhAP比 GST-ThAP对金黄色葡萄球菌抑菌活性强划痕擦伤迁移实验检测 GST-ThAP/GST-HhAP/ThAP蛋白对C6细胞迁移的影响，结果表明，培 养8h时，实验组与对照组迁移速度基本相同；培养20h时，迁移率大小 为：TrisGST-ThAP(5uL)GST-ThAP( 15uL)ThAP(5uL),GST-ThAP 和 GST-HhAP显著抑制C6细胞迁移。
综上所述，本研究构建了四膜虫及_ 论文发表专家 人类组蛋白H2A衍生的抗菌肽ThAP和HhAP的重组表达载体，在大 肠杆菌中成功表达，并且对其融合蛋白活性及功能进行了初步的分析, 为ThAP和HhAP应用及组蛋口衍生抗菌肽的深入研究提供了理论基 础和依据关键词】：H2AThAPHhAP抗菌活性表达纯化【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：TQ465【目录】：中文摘要8-10ABSTRACT10-12第一章文献综述12-211.1 抗菌肽概述12-181.1.1抗菌肽的结构特征与分类12-141.1.2抗菌肽的 作用机制14-171.1.3抗菌肽的功能171.1.4抗菌肽的制备方法171.1.5 抗菌肽的开发应用前景17-181.2组蛋白H2A衍生抗菌肽的研究 18-191.2」组蛋白H2A概述18122组蛋白H2A衍生抗菌肽的抗菌活性研究18-191.3本课题研究的意义19・21第二章组蛋H2A衍生抗菌肽的氨基酸序列分析及表达载体的构建21-332.1材料21-222.1.1菌株 和质粒212」.2主要酶及生化试剂21 -222.1.3主要试剂配制222.1.4主要仪器设备222.2实验方法22-272.2.1 ThAP和HhAP抗菌肽基因设计合成22-232.2.2ThAP和HhAP氨基酸序列分析232.2.3抗菌肽ThAP 和HhAP基因获得及融合表达质粒构建23-272.3结果27-312.3.IThAP 肽氨基酸序列分析27-282.3.2HhAP氨基酸序列分析28-292.3.3重组 表达质粒 pGEX-4T-l-ThAP 和 pGEX-4T-l-ThAP 的构建 29-302.3.4 测序30-312.4讨论31-33第三章四膜虫和人类组蛋白H2A衍生抗菌肽个易找衣冉-a% 厲 www.yiT_ 论文发表专家ThAP及HhAP的原核表达及纯化33-433.1材料33-353.1」菌株和质 粒333.1.2主耍酶及生化试剂333.1.3主耍试剂配制33-353.1.4主耍仪 器设备353.2实验方法35-383.2」融合蛋口 GST-ThAP和GST-HhAP 的表达35-363.2.2融合蛋白 GST-ThAP和 GST-HhAP的纯化 36-383.2.3四月莫虫和人类组蛋白衍生抗菌肽ThAP和HhAP的获得 383.3结果38-413.3」四膜虫和人类重组组蛋口衍生抗菌肤的诱导表 达与鉴定38・393.3.2融合蛋白GST-ThAP和GST-HhAP的亲和层析纯 化39-403.3.3凝胶过滤层析结果403.3.4融合蛋白GST-ThAP和 GST-ThAP的浓度测定40-413.3.5四膜虫和人类组蛋白衍生抗菌肽ThAP和HhAP的获得413.4讨论41-43第四章U!膜虫及人类组蛋白H2A衍生抗菌肽活性鉴定43-524」材料43-444.1.1菌株434.1.2主要酶及生化试剂434.1.3主耍试剂配制43-444.1.4主要仪器设备444.2实验方法44-464.2.1菌种复苏及菌悬液的制备44422四膜虫及人类组蛋白H2衍生抗菌肽、GST-ThAP和GST-HhAP抗菌活性的检测44-454.2.3大鼠神经胶质瘤细胞(C6)细胞的培养45-464.3实验结果46-504.3.1牛津杯法测定融合蛋白GST-ThAP和GST-HhAP的抑菌活力46-484.3.2生长抑制实验测定四膜虫组蛋白衍生抗菌肽ThAP及融合蛋白GST-ThAP和GST-HhAP的抑菌活力48・494.3.3细胞C6划痕 迁移实验49-504.4讨论50-52参考文献52-57总结与展望57-59附录59-61攻读学位期间取得的研究成果61-62致谢62-63个人简况及联。