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1、sTRAIL真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞增殖影响的体外实验研究 作者：李谷马力龚江标徐锦芳杨小锋詹仁雅【摘要】目的 构建重组基因表达载体PcDNA-sTRAIL并观察其対C6胶质瘤细胞的抑制作用。方法 通过PCR扩增和定向克降技术构建重组真核表达载体PcDNA-sTRAILo以 阳离了脂质体介导转染C6胶质瘤细胞并用流式细胞仪观测对细胞增殖的影响。结果经过 测序鉴定和蛋口表达检测证实，重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL构建成功。阳离子脂质 体介导质粒转染C6胶质瘤细胞阳性率达50%o脂质体PcDNA-sTRAIL转染C6细胞后，相比 未转染、空质粒转染、Lipofectin转染
2、组C6胶质瘤细胞增殖抑制、细胞凋广明显增加（t分 别=9.52、7.20、2.84,P均V0.05）。结论成功构建了 sTRAIL基因的真核表达载体，并从体外 实验中初步证实了其对C6胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。【关键词】 胶质瘤基因治疗真核表达载体转染口前胶质瘤的治疗是以手术为主的综合治疗，并辅以术前术后的放射治疗和化学治疗。 但总体疗效尚不理想1。基因治疗被认为是继以上治疗手段后具冇良好效果的新的治疗手 段。川溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（soluble tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligands, sTRA
3、IL）自发现并成功地克隆出来已被证实存在明确的抗肿瘤效果，为中 枢神经系统的肿瘤治疗带来了新的希望2。本次研究构建重组基因表达载体 PcDNA-sTRAIL并观察其对C6胶质瘤细胞的抑制作用，为胶质瘤治疗的进一步研究提供基 础。1材料与方法1材料1.1.1试剂及仪器 大鼠C6胶质瘤细胞系（由上海生化与细胞生物学研究所提供）； Lipofectin （由美国 Gibco 公司生产）;Access RT-PCR System（由美国 Promega 公司生产）； PcDNA（|l|美国Invotrigen公司生产）；PUCmT载体、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒 （由上海生工生物工程技术服务有限公
4、司生产）；流式细胞仪、BioER基因扩增仪（由美国 Becton-Dickinson公司生产）；NS25 OLYMPUS倒置显微镜（由LI木OLYMPUS公司生产）; 垂直电泳仪和半丁电转仪（由美国Bio-Rad公住产）;基因脉冲仪及酶标仪（由美国Bio-Rad 公司生产）。1.2实验方法1.2.1 sTRAIL的基因克隆及PcDNA-sTRAIL重纽表达载体建立 Trizol 一步法提取总 RNA,以捉取液作为模板采用cDNA逆转录与PCR扩增一步法试剂盒进行RT-PCR反应得 到DNA并纯化。引物设计如下：上游：5-GCGAATTCAGTATGGTGAGAGAAA-GAGGTC-3 （含有
5、 EcoR I 酶切位点） 下游：5-ACAGTAGGATCCTCCAGGTCAGTTA-GCCA-3 （含有 BamH I 腮切位点） 20ul反应体系中进行PCR反应，循环条件设置如F：95C 3min I个循坏；94C I min , 55C lmin, 72C lmin30s 35 个循环；72C 8min 1 个循环；4C 维持。用 EcoRI 和 BamHI 分别对载体PUCm-T和外源DNA双酶切，纯化后连接，构建T-sTRAIL质粒。T-sTRAIL质 粒转化感受态细菌TGI,用含有Amp抗性的LB培养基筛选质粒。碱裂解法抽提质粒 T-sTRAl,用EcoRI和BamHI双腮切
6、后凝胶电泳观察目的片段sTRAIL长度后并送上海生工 公司进行序列测定。鉴定无误后将PcDNA 3.1和T-sTRAIL分别用EcoRI和BamHI双酶切 并分离纯化品用T4连接酶连接，完成重组表达载体PcDNA-sTRAIL的构建并测序验证。提 取前述大肠杆菌菌落利用Western blotting进行冃标蛋白鉴定。1.2.2转染sTRAIL革因对C6胶质瘤细胞增殖影响的体外研究PcDNA-sTRAIL质粒 体外扩增后利用阳离子脂质体法介导PcDNA-sTRAIL质粒载体导入C6细胞。实验组：分别 以DMEM无血清培养基稀释5ug DNA和5ul Lipofectin至100ul,两者混匀后
7、转移到经胰酶 消化无血清培养的C6细胞培养瓶中，完全培养基继续培养2448h后，在显微镜下观察细 胞生长情况；对照组1：以同体积的PcDNA3.1代替DNA溶液；对照组2：以同体积的 Lipofectin代替DNA溶液，其它操作与实验组相同；以上三组转染细胞培养48h后传代培 养于含G418的浓度梯度培养液中进行抗性筛选稳定表达sTRAIL的C6细胞，用免疫组化 染色对表达sTRAIL基因的C6细胞进行鉴定。采用流式细胞技术（finite state machine, FCM） 的Pl染色法对成功转染PcDNA-sTRAIL基因组、空口对照组、空质粒转染组和Lipofectin 转染组进行细胞
8、凋亡检测。1.3统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件。计量资料用均数土标准差（x土s）表示。 实验组与对照纽的比较采用t检验。设PV0.05为差异有统计学意义。2结果2PcDNA-sTRAIL重组表达载体的鉴定见封二图2由图2可见，PcDNA-sTRAIL经EcoR-I和Bamh-I双酶切，电泳町见两条特界性条带， 大小分别为5.9kb和540bp左右，与预期（大小分别为6250bp和541 bp）符合，初步判定璽组 真核载体构建成功。2.2表达载体sTRAIL蛋口的鉴定见封二图3由图3可见，蛋白A经过SDS-PAGE电泳后，转PVDF膜，然后经一抗、二抗作用后, 显色后见有与目的蛋白一
9、致的结果。2.3表达sTRAIL基因的C6细胞的鉴定见封三图4由图4可见,转染后C6细胞免疫组化染色后见定位于细胞浆内呈棕黄色的明显sTRAIL 阳性邙日性率达1（）%5（）%不等）。细胞形态与对照组类似，呈现胶免疫纟fl化染色质瘤细胞 的形态特征。对照组未见相应蛋白表达。2.4 sTRAIL诱导的细胞凋亡的结果见封三图5山图5可见，FCM的P1染色法检测sTRAIL诱导的细胞凋广结果配示转染外源基因 sTRAIL后，C6转染组可见明显亚二倍峰形成，较其他组明显增加。2.5 FCM记录的各实验组细胞凋亡率比较见表1由衣1可见，脂质体转染C6细胞后可见PcDNA-sTRAIL组细胞凋亡率较空口对
10、照组、 空质粒转染组和Lipofectin转染组增加（t分別=9.52、7.20、2.84, P均V0.05）。3讨论TRAIL与FasL、TNF-a同属于TNF配体家族，虽然后两者都能诱导肿瘤细胞凋亡， 但TNF- a会激活核因了 NFk B而产生严重的炎症反应，而FasL会引起致命的肝损伤， 因此限制了它们在肿瘤治疗上的应用。TRAIL与其他两者比较，其不同Z处在于:TNF与 FasL大都表达于激活的免疫细胞，Ifu TRAIL却持续地表达于大多数正常细胞中；具有强 大诱导肿瘤细胞凋广的能力，但対正常细胞基本无影响；有更广的抗癌谱；対核因子NF kB仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也
11、不会象TNF-a那样产牛严重的炎症反应。 因此，TRAIL被认为是一种更为安全且极具潜力的抗肿瘤因子。这预示着TRAIL可能成 为一种新的抗肿瘤药物3, 4o自1995年人们发现并成功地克隆出TRAIL基因来，多位学者证实了 TRAIL的存在和 明确的抗肿瘤效果，为中枢神经系统的肿瘤治疗带來了新的希望。TRAIL基因定位于染色 体3q26,编码281个氨基酸，属于II型跨膜蛋白，N端15-40氨基酸为疏水区域并形成跨 膜结构，胞内区很短，胞外区与sTRAILL的同源性高达28%左右5。TRAIL广泛表达于正 常人除脑、肝和睾丸以外的各种组织。膜结合型TRAIL（全长的TRAIL）和可溶型TRA
12、IL（胞 外区c端的168个氨基酸）在体外均能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，作用谱很广，但是正常细 胞则对TRAIL不敏感。英主要的机理之一是组织细胞膜表血的和应受体的不同分布有关。sTRAIL基因要在临床正式应用而起到有效的治疗作川，口前需要进一步明确调控机制, 特别是关于转录因子对它的调节，并ft进一步探讨影响其效果的相关因素而匝要前提是找到 有效的载体。目前有两人类基因治疗载体系统：病毒载体和非病毒载体。前者包括逆转录病 毒、腺病毒、单纯疱疹病毒和腺相关病痔等；后者则包括脂质体、多聚阳离子载体等。病毒 载体导入效率明显肓于非病毒载体，但是存在诸如免疫反应、致病性、靶向性方而的问题。 木次研究采
13、用示一种载体，具有较高的安全性，而且PcDNA3是被广泛应用的有效载体6。本次研究发现，TRAIL是通过其受体而发挥作用，而TRAIL的受体有多种，目前发 现了至少五种TRAIL受体:DR4(死亡受体4)、DR5(死亡受体5)、DcRl(诱骗受体l)、DcR2(诱 骗受体2)和DcR3(诱骗受体3)。DR4和DR5广泛表达于正常组织细胞和肿瘤细胞，DcR 1 或DcR2表达于正常组织细胞。由于DcRl和DcR2的膜外区均有两个与DR4和DR5高度 同源的富含半胱氨酸的伪重复序列,能够与TRAIL结合,但DcRl胞内没有死亡结构域(death domain, DD), DcR2在胞内冇一部分DD
14、,与TRAIL结合后，凋亡信号传递中断，正常细 胞可以逃逸TRAIL的凋亡诱导作用。但是肿瘤细胞只表达DR4和DR5,而DcRl、DcR2 和DcR3等诱骗受体表达很少，所以TRAIL nJ以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡。本次研究通过RT-PCR技术成功克隆了人类sTRAIL基因，并应川定向克隆技术成功构 建sTRAIL真核表达载体PcDNA-sTRAILo体外实验证实表达载体具有高效、稳定的表达 sTRAIL的能力。FCM技术证实，与空质粒和PBS对照组相比，成功转染PcDNA-sTRAIL 组的肿瘤细胞生长明显抑制。并且与对照组相比，细胞增殖抑制，凋亡明显。上述体外实验 结果提示，转染sTRA
15、IL可作为治疗胶质瘤研究中一个可行的方法。晋升网()致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录 医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄选 海虽优秀医学论文检索，独立研发保学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊类、 标题、关键诃检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、在线查稿、 在线阅读、远程审稿、在线下载等系统；聚刊社力量，建服务平台，让晋升网通过“专业” 走入每一个医务人员的身边是我们不懈的追求冃标；【参考文献】1 Gilbert MR, Loghin M The treatment of malignant gli
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