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1、甲型流感疫苗的制备实验一鸡胚增殖病毒实验目的：通过该实验的学习，掌握鸡胚尿囊腔接种技术。实验器材：甲型流感病毒(无菌、血凝效价在1： 120), 9-11日龄发育良好的鸡胚，照蛋器, 一次性采血针，50ml的烧杯，2%碘酒棉球，75%酒精棉球，1ml的一次性空针等。实验步骤：尿囊腔接种法1、选用9-12 0龄发育良好的鸡胚，照蛋画出气室及胚胎位置，分别在气室顶端和底边胚 胎附近无大血管处标记。2、气室向上放置鸡胚于无菌的50ml的烧杯上，在气室标记处上下用碘酊和酒精棉球消 毒。3、在两个标记处用一次性采血针打孔，为防止注射时胚胎内产生压力使接种物溢出，可 先在气室顶端打孔。4、用1ml的空针抽
2、取甲型流感病毒稀释液，针头斜面与鸡胚呈3()度角刺入尿囊腔内 3-5mm,注入甲型流感病毒稀释液0.2ml。5、另一种接种方法是只打一小孔，在距气室底端0.5cm处打孔接种。6、注射完毕，用熔好的石蜡封闭注射孔，气室朝上于35-37摄氏度孵育。弃24小时内 死胚，以后每天检查鸡胚1一2次。7、收集24小时以后死亡的鸡胚和孵育48-72小时得活胚，置于4度冰箱过夜或2OC1 小时，防止收获病毒时流血。实验二 病毒液的收集、血凝效价检测和灭活实验目的：以无菌操作技术收获病毒液。实验器材：无菌吸管，无菌的50ml烧杯，2%碘洒的棉球，75%洒精的棉球，眼科蹑子，灭 菌的青霉素瓶，灭菌的EP管，1%鸡
3、红细胞，血凝板，0.85%生理盐水，1ml和100ul的移 液器，1ml和100ul的灭菌枪头。实验步骤：1、将收获病毒用的器具清洗。2、高压灭菌，置于超净工作台紫外线灭菌。3、取出冷却的鸡胚，消毒，蹑子敲破气室部卵壳，去除壳膜，撕破绒毛尿囊腔，用锻 子捏住尿囊膜，吸管吸出尿囊液，羊水置于灭菌的青霉素瓶和灭菌的EP管众，-20C保存备 用。4、血凝效价的检测4取一干净的血凝板，每孔加生理盐水50ul,加至12孔。4.2第一孔加入病毒液50ul,倍比稀释至11孑L,余下的弃去。第12孔作为对照，不加病 毒。4.3每孔加入1%红细胞50ul,震荡，混匀，37C,反应15分钟，观察结果。4.4效价判
4、断：凝集现象特别明显：“+”，凝集现象次之：“+”，凝集清楚可见：“+”，稍显凝集者：“ + ”。5、病毒液的灭活：将收获的病毒液合并，按体积加入终浓度为0.05%的甲醛，置4摄氏 度灭活72小时，经浓缩和纯化，获得病毒原液。实验三 无菌检测实验目的：检测病毒原液是否有菌。 实验器材：试管，改良肉汤培养基, 实验步骤：1清洗实验器材，2配制改良肉汤培养基，按要求灭菌，制成固态，液体培养基。配方：葡萄糖10glog5g5g3g蛋口冻牛肉膏 水解乳蛋白氯化钠去离子水IL用 INaOH 调 PH 至 7.2-7.6固体培养基 加入1.8%琼脂：3取0.2ml的灭活的病毒液接种液体的改良肉汤培养基或固
5、体培养基试管的斜面上，置 37C培养过枚，观察有无细菌生长。实验五加入防腐剂、分装冻干和使用说明实验目的：在疫苗半成品中加入硫柳汞防腐剂，学会分装冻干疫苗，学会书写使用说明。 实验器材：10*的硫柳汞（0.5mg/ml）共6ml,灭菌的青霉素瓶，1ml和200ul的枪头，75% 酒精棉球等。实验步骤：1、加防腐剂：根据各单价病毒原液血凝素滴度，分别按比例混合后，进行适当稀释，加 入硫柳汞作为防腐剂，加入硫柳汞的量，每剂50ug,即为疫苗半成品。2、分装：每剂分装成0.5ml或lml。3、真空冷冻干燥：将疫苗半成品放入真空冷冻干燥机中按程序冻存。4、保存、运输及有效期：于28C避光保存和运输。自
6、血凝素含量检定合格之日起，有 效期为1年。5、使用说明 附录：生物制品分装和冻干规程本规程仅适用于生物制品的注射剂，而生物制品的胶囊剂、片剂、散剂、滴 眼剂、栓剂及其他剂型的分装耍求和实际装量等，均按“制剂通则”（附录I）中冇 关规定执行。一、质量保证部门认可 待分装、冷冻于燥（以下简称冻干）的半成品，须经 质量保证部门审查或检定，对符合质量标准者，发出分装通知单后，方可进行 分装或分装后冻干，冇专门规定者除外。二、分装、冻干用容器及用具1. 分装、冻干制品的最终容器的原材料标准，应符合国家药品包装用材料和 容器管理的标准。玻璃容器至少经高压蒸汽121C灭菌I小时，或下-热180C灭菌2 小时
7、，或以能达到同样效果的其他灭菌方式处理，不得冇玻璃碎片脱落和碱性物质析出。2. 凡接触不同制品的分装容器及用具必须分别洗刷。血淸类制品、血液制 品、卡介苗、结核菌素等分装用具必须专用。三、分装、冻干车间1. 分装、冻干车间应符合现行中国药品生产质量管理规范的要求。2. 灭活疫苗、重组疫茁、类毒素及细胞提取物，在其灭活或处理到完成纯化 工序后，可以与其他无活生物体制品交替使用同一分装问和分装、冻干设施， 但在-种制品分装后，必须进行有效的清洁和消毒，清洁效果应定期验证。四、人员直接参加分装、冻干的人员，每年至少应做一次健康检查。凡患冇活动性结 核、病毒性肝炎感染者或其他冇污染制品危险的传染病患者
8、，应禁止参加分 装、冻干工作。五、待分装半成品的规定1. 待分装Z半成品，英故近一次无菌检查不得超过6个月，超过6个月者，应 重新抽样检定。2. 待分装制品的标签必须完整、明确，品名和批号须与分装通知单完全相 符，瓶口需包扎严密，瓶塞须完整，容器无裂痕，制品之外观须符合各论的 要求。3. 待分装制品的存放和运输必须采取严密的防污染措施。六、分装要求1. 分装前应加强核对，防止错批或混批。分装规格或制品颜色相同而品名不 同，或活疫苗与其他制品不得在同室同时分装。2. 全部分装过程中应严格注意无菌操作。制品应尽量采用原容器直接分装( 有专门规定者除外)，同一容器的制品应当日分装完毕。原容器为大罐当
9、日未 能分装完者，可延至次II分装完毕。不同亚批的制品不得连续使用同一套灌注 用具。3. 制品分装于安寵后应立即熔封。分装于玻璃瓶或塑料瓶者，须立即加盖瓶 塞并用灭菌铝盖加封。除另有规定外，应采用减压法或其他适宜的方法进行容器检漏。4. 活疫苗及共他对温度敏感的制品，在分装过程中制品应维持在25C以下或 对制品采取冇效的降温措施。分装后之制品应尽快移入28C冷库贮存。(冇专 门规定者，按有关各论的要求进行。)5. 含有吸附剂的制品或其他悬液，在分装过程中应保持均匀。6. 分装所用最终容器及瓶塞，应不影响内容物的生物学效价、澄清度和pH。7. 制品实际分装量 瓶装制品的实际装量应多于标签标示量，
10、分装100ml者补加04. 0ml分装50ml者补加1. 0ml分装20ml者补加0. 60ml；分装l()ml者补加().50ml- 分装5ml者补加0.30ml；分装2ml者补加0.15ml；分装lml者补加0.10ml；分装0.5ml者补 加0,10ml.保证做到每瓶的抽出量不低于标签上所标明的数量。抗毒素除上述 规定外，按单位计算另补加10%或20%。预充式注射器的实际装量应不低于标示量。七、冻干要求1. 应根据制品的不同特性，制定并选择相适应的冻干工艺和冻干Illi线，并冇自动扫描记录。不论任何制品，冻干全过程都要做到严格的无菌操作。2. 应根据制品的不同特性，选择适宜的冻干赋形剂。
11、赋形剂的质量应符合不版药典或国家相关标准的耍求；其品种和用量应当无害，不影响制品安全性 和有效性，并应对规定的检定方法无干扰。3. 真空封口者应测定真空度。充氮封口应充足氮量，氮气纯度应不低于99.99%。八、分装、冻干卡片和记录分装后Z制品要按批号填写分装、冻干卡片，注 明制品名称、批号、亚批号、规格、分装II期等，并应立即填写分装和冻干记 录，并冇分装、冻干、熔封、加塞、加铝盖等主要工序中直接操作人员及复核 人员的签名。九、抽取无菌检查供试品分装、冻干后制品每批或亚批按无菌检查法（附 录XHA）检定，在分装过程的前、中、后三个阶段或从不同层冻干柜中抽取样 品，送质量检定部门检定。不同机柜冻干的制品应分别抽样做无菌检查及水分 测定。
