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1、血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体的制备及鉴定作者：石琦，单冰，高晨，姜慧英，张宝云，韩俊，董小平【摘要】 目的：制备血管内皮生长因子Q間单克隆抗体（nb）,并对其特 性进行鉴定。方法：以重组His Trx VKF1 165蛋白为抗原，通过免疫、融 合、克隆和筛选等方法制备VBSFinAb,制备小鼠腹水并测定其效价、染色体数 目及免疫球蛋白亚类，用Astern blot方法分析其特异性。结果：成功筛选出能 稳定分泌的杂交瘤细胞株4E4 H5,制备腹水的ELIS磁价为1： 106; 染色体数目为105条；抗体分型为1心1亚型，轻链；Astern blot证实所获 得的 啟可与VKF全长蛋白发
2、生特异性反应，但是与融合蛋白的标签蛋白HisTix不发生反应。结论：制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高滴度和高特异性的 VB3F mAb,为建立能够用于肝癌诊断的血清VBGF检测技术提供了参考。【关键词】血管内皮生长因子单克隆抗体酶联免疫吸附试验血管内皮生长因子Vascular endothelial growth factor, VKD最早是出 Leunq等Cl于1989年在牛垂体星状细胞培养液中提纯的蛋白质。它是胚胎发生 和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异的有丝分裂原，也是一种血管形 成和血管通透性诱导因子，在血管发生和形成过程中起着重要的调控作用。肿 瘤的生长和转移是一个多步骤的复杂
3、过程，其中肿瘤血管的生成起重要的作用。迄今为止,VB2F被认为是肿瘤组织中促血管生成的最主耍的血管生长因子氏。近年来，人们已经在人和动物的多种肿瘤组织，包括肝癌细胞中都发现VB3F的 过度表达，且表达水平随着癌变程度增加而逐渐升高。另外，VBT的表达与血管生成及细胞增生程度相关，且其过度表达影响肿瘤的侵袭和转移。基于这些理 原制备了小鼠抗人VB药全长蛋白的单克隆抗体（nAb）,并对其特性进行了鉴定, 获得了能稳定分泌抗VB3F iiAb的杂交瘤细胞株。论基础，我们在原核系统中表达了含165个氨基酸的V涂长蛋白,以此为免疫1材料和方法1.1 材料 His Trx VB3F1 165蛋白、pET
4、32a载体、Sp）小鼠 骨髓瘤细胞株由本室制备保存；弗氏完全、不完全佐剂购自Si和a公司；次黄瞟 吟 氨基蝶吟 胸腺唏喘核昔（HU）及次黄卩票吟 胸腺唏喘核昔（HI）购自 Hyc 1 one公司；PB31500购自 Roche公司；anti VBlFirAb购自 磁arrp;D公司；辣 根过氧化物酶（两 山羊抗小鼠勾自PIERCE公司；小鼠mAb分型检测试剂 盒购自Roche公司；ECL检测试剂盒购自Perk inElmer公司；ELI SA显色液购自北 京万泰生物公司；纯系小鼠（48周龄，雌性，质量1720劝，购自 北京生物制品研究所动物部。1. 2方法1. 2. 1免疫动物 将100卩够屯
5、化的His Trx VKF1 165蛋白与等体积 的弗氏完全佐剂混合，充分乳化，经腹腔注射免疫BA&t小鼠。以后每隔2周进 行1次免疫，采用100卩gHis Trx VffiFl 165蛋白与等体积的弗氏不完 全佐剂混合、乳化后经腹腔注射免疫，共免疫4次。1. 2. 2杂交瘤细胞株的制备提前制备正常RXL肌小鼠腹腔巨噬细胞作为滋 养细胞，进行细胞融合:末次免疫后3蹶脾，同时眼部取血，离心分离血清 备用。将小鼠脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0细胞按10： 1比例混合于50 mL 尖底离心管中，置于37C水浴中，于lniin内缓慢滴入ImL预热的PB31500,静 置5min,用无血清RM164
6、0液终止作用，离心收集细胞。将细胞首先悬于含HOT 的选择培养基中，接种于96孔培养板中，100卩 W,接种密度为每孔1个或2 个细胞，10 d后改用HT培养液，3周后改用普通RIMI1640培养液（含200 S 胎牛血清）培养。1. 2. 3克隆细胞株的筛选培养应用间接ELISA法：融合后4 12 d,待 融合细胞生长到培养孔的时，取上清用间接ELISA法进行筛选。包被用抗原为可溶性重组His Trx VKF1 165蛋白50ngL,融合细胞上清加100 卩 W,以Sp0细胞培养上清液作为阴性对照，阳性对照为商品化的VKFmAb, 二抗为1： 4000 HRP山羊抗小鼠1也100 p ML,
7、经TNB底物显色后，酶标 仪测定A450值。凡A45O值大于阴性对照（SpM细胞培养上淸）2倍以上者，初 步判定为阳性克隆。选择阳性孔用有限稀释法进行 斤4次亚克隆，建立稳定分泌 VB3FnAb的杂交瘤细胞株，至所有杂交瘤细胞上清液均呈阳性为建株标准，扩大 培养后液氮冻存。1. 2. 4杂交瘤细胞染色体的检测将杂交瘤细胞培养至对数生长期加入终浓 度为0.3说的秋水仙素，于37C继续培养46 h,收集细胞，加入预热的 0. 075 molAK31, 37C保温30mii%用甲醇与冰醋酸混合液（二者比例为3： 1） 固定3次，制片，Giemsa染色，进行观察。每份标本计数100个完整的中期细胞，
8、计算染色体的平均数量。1. 2. 5腹水制备及抗体纯化小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0. 5 nt帜，7 14 d后，经腹腔接种杂交瘤细胞（104 107个/） 5 ml）。待小鼠出现腹部肿胀、 消瘦、呼吸急促、活动减少等体征时，开始收集腹水，2000 i/fnin离心lOmin, 收集上清分装保存于一70C备用。1. 2. 6 Ig亚类（型）的鉴定取杂交瘤细胞培养上清液，按Si和a公司小鼠 血亚型检测试剂盒操作说明进行。1. 2. 7festern blot检测 血 的特异性 将载体pET 32a转化大肠杆菌 EL21 CE3）后表达纯化的His Trx蛋白及纯化的His Trx VB3F1 1
9、65蛋白 经SC6 MGE电泳后，电转至硝酸纤维素膜，一抗为制备的VBTm心1： 100Q） 稀释，二抗为H& 羊抗鼠多抗（1: 5000）稀释，ECL显色。2结果2. 1 VB3F iiAb杂交瘤细胞系的建立使用PB31500对免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp）融合，第5天开始岀现融合细胞。经ELISA方法检测，凡A45O 值大于阴性对照（Sp）细胞培养上清）2倍以上者，初步判定为阳性克隆。计 数杂交瘤细胞阳性孔数，计算其与成功生长杂交瘤细胞孔数之比，计算得杂交瘤细胞阳性率为20. 5%经VF特异性间接ELISA筛也获得8个阳性的融合细胞孔。对8个阳性孔再进行一次性克隆，ELISA筛选有1
10、5个单克隆细胞株抗体检测 为阳性。对其规律传代培养至第5代，ELISA检测每代细胞分泌抗体情况，4E4H5细胞株能够稳定分泌抗VB3F抗体。将此细胞株体外继续培养1个月后液氮冻存，复苏后仍能稳定分泌抗MF抗体。2. 2mb滴度的测定用间接ELISA法测定抗体滴度，设立4个平行孔，计算 其平均值得到最终滴度值。以此稳定分泌VBT mAh的杂交瘤细胞株4E4 H5腹 水效价为1： 10623杂交瘤细胞株染色体数目及抗体亚类和型的鉴定 应用秋水仙素法检测 得染色体数日为105条，基本符合脾细胞和Sp）细胞染色体数目之和。杂交瘤 细胞株所分泌的抗体为1/1亚型，x轻链。2.特异性鉴定 应用Astern
11、 blot方法对获得的riAb进行检测，此株血能与纯化的His Trx VB3F1 165蛋白发生特异性反应，在Mr 38000 的位置可见明显条带（图1）,但是与融合蛋白的标签蛋白His Trx不发生反 应。图1促stern blot鉴定mAb的特异性（略）1: His Trx, 2: His Trx VB3F1 165; M 蛋白 marker.3讨论近年来大量研究表明，VKF作为血管新生重要调节因子，在绝大多数恶性肿 瘤中（包括血液系统恶性肿瘤）均呈现高表达。一些研究也证实，肝癌组织中VB3F 的表达水平与肿瘤血管发生和病情进展有着显著的关联性Ho VB3F是肝素结合 型二聚体糖蛋白，有
12、5种剪接异构体，分别包括121、145.165.189206个氨基酸，但是VB3F 165是体内最丰富的亚型，具有最有力的生物学活性，因 此，我们在选择免疫原时，选择了在组织中含量最高，分布最广的含165个氨基 酸的VB3F蛋白冈。本研究中，以纯化的重组VB3F蛋白为抗原，腹腔注射多次免疫获得能够分 泌抗VKTrb的小鼠脾细胞。在PK31500的诱导下，小鼠脾细胞能较好地与SPM） 骨髓瘤细胞在体外融合，建立的能稳定分泌抗VBSFmAb的杂交瘤细胞株在体外连 续传代5次（连续培养2个月），其分泌抗体的能力没有明显变化。经冻存复苏 后，杂交瘤细胞长势良好，仍能稳定地分泌mAb,表明本研究建立的杂
13、交瘤细胞 株具有较好的稳定性。我们将此株 血与免疫原蛋白及其标签蛋白进行Astern blot反应，其只与免疫原发生特异性反应，表明此株 忒能准确识别VKF抗原，同时具有良好的特异性。另外，我们在Sp)骨髓瘤细胞培养方面也做了一些改 进和尝试，将lx 10L密度的细胞0. 5 mL注射至小鼠腋下，使得肿瘤细胞在局 部生长1卜14 d,当肿瘤大小直径约1 cm时，处死小鼠，研磨组织获得SpM) 细胞培养23d,观察细胞状态良好时，即可进行融合实验。此方法获得的Sp2/0 细胞状态好，而且细胞培养时间易于掌握，节省很多人力和时间。VHTmAb的制 备为进一步深入研究VB3F的生物学功能，建立能够用
14、于肝癌诊断的血清VB3F检 测技术提供了参考。【参考文献】DO Leunq DY Cachianes Q Kuang et al. Vascular endothel ial growth factor is a secreted angiogenic mitogen OQ. Science, 1989, 246 0935): 13041309.Z Wizignann g hemangi obi as tcmas J.Plate KH Pathology,Histol Histopathol,genetics and cel 1 bio 1 ogy of 1996, 11 ：1049-1061
15、.DO Kim 耳 Kim S, Shim J, et al. Neurogenic effect of vascular endothel ial growth factor during germ layer formation of human onbryonic stem cells . FEBS Lett, 2006, 580 05): 5869-5874.KI Sal ven F； Ljmboussaki A Heikki la F； et al. Vascular endothelial growth factors VffiF B and VKF C are expressed
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