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1、SDSPAGE电泳过程中常见问题以 及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS -PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到 的问题进行一些讨论：Q: SDS - PAGE电泳的基本原理？A: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS （十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电 荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其 序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只 与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1
2、.4g去污 剂结合。当分子量在15KD到200KD 之间时，蛋白质的迁移率和 分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋 白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得 分子量。Q:配胶缓冲液系统对电泳的影响？A:在SDS - PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 Tris HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7 ,分离胶pH8.9 ;而电泳缓冲液 使用的Tris -甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其
3、在电场的作用下，泳动效率低；而 CL离子 却很高，两者之间形成导电性较低的区带， 蛋白分子就介于二者之间 泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压 剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进 入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动 速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电 场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因 素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。Q:样品如何处理？A:根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS
4、处理、 非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原 SDS处理。1、还原SDS处理：在上样buffer 中力口入SDS和DTT （或Beta 航基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS与蛋白 相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种 方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样 Buffer ,离心，沸水煮 5min ,再离心加样。2、带有烷基化作用的还原 SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以 很好的并经久牢固的保护 SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可 捕集过量的DTT ,而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中 10ul 20 %的碘乙酸胺，并在室温保温 30
5、min 。3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1 %SDS沸水中煮3min ,未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可 作为测定分子量来使用。Q : SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用？A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，具凝固的 好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.7 ,分离胶选择pH8.9 ,选择trisHCL系统，具体作用后面介绍；TEMED与AP:促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS ）:阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、 解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、
6、去多肽折叠。Q:提高SDS-PAGE 电泳分辨率的途径？A: 1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料 又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术 手册P82-103。Q:微笑（两边翘起中间凹下）形带原因？A:主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝 胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。Q：皱眉”（两边向下中间鼓起
7、）形带原因？A:主要出现在蛋白质垂直电泳梢中，一般是两板之间的底部间隙气 泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。Q:为什么带出现拖尾现象？A:主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂； 电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。Q:为什么带出现纹理现象？A:主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。Q:什么是鬼带”，如何处理？A :鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时， 常会出现在泳 道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉 淀，主要由于还原剂在加热的
8、过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有 相同的免疫学活性，在 WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体 作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT或Beta航基乙醇， 以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA来阻止还原剂的氧化。 Q：为什么澳酚蓝不能起到指示作用？A：我们在实验中常会遇到澳酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下 来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer ;降低分离胶的浓度。Q:为什么电泳的条带很粗？A:电泳中条带很粗是常见
9、的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7 );适当降低电压；Q:为什么电泳电压很高而电流却很低呢？A:这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v以上，可电流却在 5mA以下。主要是由于电泳梢没有正确装配，电流未形成通路。包 括：a.内外梢装反；b.外梢液过少；c.电泳梢底部的绝缘体未去掉(比 如倒胶用的橡胶皮)。处理办法：电泳梢正确装配即可。Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？A:这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主 要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹 子后，板未压紧而致空气进入引起
10、的。简介聚丙烯酰胺凝胶电泳作用：用于分离蛋白质和寡糖核甘酸作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。它有两种形 式：（1）非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整 状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而 逐渐呈梯度分开。而SDS-PAG取根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技 术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中 加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基 分子量的大小（可以忽略电荷因素）。作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子 间的氢键，使
11、分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如 琉基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶 中加入还原剂和 SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样 就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGJ般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够 有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样 品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。 当样品液和浓缩胶选 TRIS/HCL缓冲液，电极液选 TRIS/甘氨酸。电泳开始 后
12、，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电 荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居 中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区， 而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨 酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓 缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与 所带电荷和分子形状无关。补充信息聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE （Polyacrylamde gelelectrophoresis ）聚丙烯酰氨凝胶电泳,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一
13、种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝 胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完 成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸俊（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（ TEMED为加速剂。在聚合过程 中，TEMEDW化过硫酸俊产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲 叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。PAGE据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续 系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在
14、电场中泳动不仅有电荷效应，分子 筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris- 甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形 成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要 因素。过程蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷 以及分子的大小 和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因
15、素消除，那电 泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（ SDS具有这种作 用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和琉基乙醇，SDS可使蛋白质分子中键二硫键还原。由于十二烷基硫酸1!带负电，使各种蛋白质一SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质问原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质一SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A,这样的蛋白质一SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质一SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯 酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小， 迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电 泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD至I 200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX,式中：MW的分子量，X为迁移率，k、b均为
