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1、MM_FS_CNJ_0161出口食品 弯曲杆菌 微生物法MM_FS_CNJ_0161 出口食品中弯曲杆菌检验方法 本方法适用于出口畜肉、禽肉、水产品和牛奶中弯曲杆菌检验。其他出口食品可参照使用。2.培养基、试剂和仪器 弯曲杆菌增菌肉汤：根据用途，加入1号或2号抗生素溶液制成(A1)； 弯曲杆菌分离琼脂(改良Skirrow氏培养基)(A2)； 含0.18%琼脂的半固体布氏肉汤(A3)； 布氏琼脂(A4)； 营养肉汤(A5)； 中性红溶液(A6)； 3%过氧化氢溶液； 氧化酶试验试剂(A7)； 亚硝酸盐检测(硝酸盐还原)试剂(A8)； 乙酸铅纸条：将滤纸条浸入饱和乙酸铅溶液中，然后取出，使其干燥；
2、 硝酸钾； 甘氨酸； 氯化钠； 盐酸半胱氨酸(cysteine-HCl)； 马尿酸钠(sodiumhippurate)； 萘啶酮酸(nalidixic acid)：每个圆纸片含30g； 头孢菌新素(又称先锋霉素I，cephalothin)：每个圆纸片含30g； 茚三酮(ninhydrin)； 丙酮； 丁醇。 微需氧培养设备：最佳微需氧条件为5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。可用具双相压力计的厌氧罐、蜡烛缸、气袋或其他可代用的装置； 天平：称量2000g，感量0.1g； 均质器； 离心机：带50mL离心管； 显微镜：相差或暗视野； 培养箱：25，37和42； 水浴箱：37； 注射器：20mL
3、；m； 三角烧瓶：50，250和500mL； 平皿：90或100mm； 吸管：1和5mL； 试管：16mm125mm，带螺旋帽。 使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取25g样品，置于均质杯内，加入100mL增菌肉汤。用均质器以800010000r/min均质30s。将均质液通过灭菌纱布，倒入一个容量为250mL的三角烧瓶，置微需氧条件下，42培养2448h。 在一个灭菌容器中，用250mL灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min。取肉汤，经灭菌纱布过滤，于23000g、4离心20min，或于16300g、4离心30min，弃去上清液，将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶中的100mL加有按
4、1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤中。培养方法同3.1条。 使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取约40g牛奶放入离心管中，按3.2条中的方法离心。弃去脂肪和上清液，将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶内的100mL增菌肉汤中，培养方法同3.1条。 使用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。将100g样品和100mL增菌肉汤放入均质杯中，用均质器以800010000r/min转速均质30s。用灭菌纱布将均质液过滤。取50mL滤液放在500mL三角烧瓶内的200mL增菌肉汤中，培养方法同3.1条。 所使用的增菌方法决定于食品的种类。虾、整只海鱼和海鱼片经表面洗涤法(3.2条)处理后
5、，用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤增菌。羊肉和猪肉块可先用表面洗涤法处理，再用加有按1号配方配制的抗生素的肉汤增菌。碎肉按3.1条所列方法处理。液体食品按3.3条所列方法处理。各种样品的培养方法均同3.1条。m孔径滤膜过滤。取经过滤和未经过滤的增菌培养物，分别在分离用琼脂平板上划线接种，各不少于两个平板。将平皿置微需氧条件下42培养2448h。检查平板上有无透明-白色-棕黄色(可能出现浅红色)凸起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落。挑取典型菌落制作湿片，用相差(或暗视野)显微镜检查，本菌呈现快速的螺旋样运动。涂片作革兰氏染色镜检时，本菌为革兰氏阴性，如小逗点状，两菌体的末端相接
6、时，呈S形、海鸥展翅形或螺旋状。挑取初步鉴定为弯典杆菌菌落，在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上。根据生化、生长特性和抗生素敏感性试验进行菌株证实。 从用作纯分离的平板挑选2个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环，分别接种于放在50mL三角烧杯中的4mL布氏肉汤中，置微需氧条件下42培养2428h。同时接种一份已知阳性培养物，以在整个证实试验中作为对照。在大多数情况下，用于生长试验和生化反应的基础培养基是含0.18%琼脂的布氏肉汤。这种培养基分装在16mm125mm试管中，每管7mL。从所有布氏肉汤中取出各接种物，滴加0.20.3mL于琼脂表面。 接种3管含0.002%中性红(NR)的基
7、础培养基，其中一管置37培养，检查在这一温度下的生长情况，并用于观察过氧化氢酶反应。另两管分别置42和25培养。每日检查有无生长。对未生长者需培养5d，方可作出最后判断。弯曲杆菌的生长应只限于接近培养基表面的一薄层，广泛的生长不是由于弯曲杆菌属细菌所致。 滴加3%过氧化氢溶液于显示有细菌生长的试管内，出现气泡者为阳性反应。 使用琼脂平板表面经24h培养的生长物(也可取用于抗生素试验的平板)。将氧化酶试剂滴于棉拭子上，并用棉拭子去接触表面生长物。在接触点出现深蓝色斑点者为阳性。 将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基。置空气中于37培养5d。加入亚硝酸盐检测试剂甲液和乙液(A8)，出现红色者
8、表明硝酸盐还原成亚硝酸盐，为阳性反应。5.1.5. 1%甘氨酸中生长试验 将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基。置空气中于37培养。每日检查有无生长，对未生长者需培养5d，方可作出最后判断。5.1.6. 3.5%氯化钠中生长试验 将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基。置空气中于37培养。每日检查有无生长，对未生长者需培养5d，方可作出最后判断。 将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基，将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部(不让滤纸条接触培养基)，旋紧试管帽。置空气中于37培养。每日检查，观察滤纸条是否变黑，纸条变黑表明有硫化氢产生，为阳性
9、反应。对未出现阳性反应者需培养5d，方可作出最后判断。 马尿酸盐水解培养基即1%灭菌马尿酸钠溶液，可用试管分装，每管0.4mL，冻存备用。用2mm接种环取一满环在琼脂平板上培养过夜的生长物，接种1%马尿酸钠溶液中，振摇试管以分散培养物，置371丙酮和丁醇的混合物中，将试管于室温下放置2h。出现紫色者为阳性反应。 用灭菌棉拭子将预先准备的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。将含头孢菌新素(30g)和萘啶酮酸(30g)的圆纸片分别贴于平板表面。置微需氧条件下于37培养24h，检查有无抑菌圈。弯曲杆菌的特性鉴别试验项目弯 曲 杆 菌胎儿弯曲杆菌胎儿亚种空肠弯曲杆菌结肠弯曲杆菌NARTCD过氧化氢酶氧化酶硝酸盐还原半胱氨酸形成H2S1%甘氨酸中生长3.5%氯化钠中生长37生长25生长42生长马尿酸盐水解萘啶酮酸试验R2)S2)SR头孢菌新素试验SRRR注：1)NARTC为抗萘啶酮酸嗜温弯曲杆菌。 2)R为耐受；S为敏感。6.来源： SN 017592
