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1、平颤颗粒治疗帕金森病药效学探究【摘要】目的：观察平颤颗粒对帕金森病(PD)模型 鼠的行为及多巴胺能神经元的影响并探讨其治疗PD的作用 机制.方法：运用6軽基多巴胺两点注射法损毁大鼠右侧 黑质致密部(SNC)和腹侧被盖区(VTA)多巴胺能神经元，制备 PD模型，将模型成功大鼠随机分为模型组、美多芭组、平颤 颗粒低、中、高剂量3组以及联合用药组，另设正常对照组, 每组10只，分别给予相应处理，连续5 wk观察各组大鼠处 理前及处理后3, 4, 5 wk行为学的变化，通过脑黑质酪氨 酸務化酶(TH)免疫组化染色观察多巴胺(DA)能神经元的 损伤程度，并采用高效液相色谱法观察脑黑质DA及3,4二 軽基
2、苯乙酸(DOPAC)含量变化.结果：平颤颗粒高、中剂量 组大鼠的旋转次数多于美多芭组及联合用药组(P<；0. 05),但均少于模型组(P<；0. 05 或 P<；0. 01), 模型组大鼠与治疗前比较旋转次数有显著增加 (P<；0. 05),正常组大鼠行为则无变化；免疫组化检测显 示平颤颗粒高、中剂量组黑质TH阳性神经元数目髙于模型 组，但低于正常组(P<；0. 05)；高效液相色谱电化学检 测结果表明，各组大鼠中脑DA及D0PAC含量均低于正常组, 平颤颗粒高、中剂量组低于联合用药组及美多芭组(P<；O. 05),而平颤颗粒低剂量组与模型组比较差异无显 著性.结论：平
3、颤颗粒能部分改善PD大鼠旋转行为，并减 轻黑质细胞的受损程度，提高下降的DA水平，从而对PD起 到治疗作用.【关键词】帕金森病；平颤颗粒；旋转行为；酪氨酸单 氧化酶；多巴胺Abstract AIM： To observe the effects of Pingchan Potion on the rotation action and the dopaminergic neuron in Park in son disease (PD) model rats and explore the pharmacodynamics of Pingchan Potion. METHODS： PD mod
4、el rats were established by microinjection of 6 hydroxydopamine solution into right ventral tegmental area (VTA) and substantia nigra pars compacta(SNC) of the mesencephslon. The 60 PD rats were divided randomly into six groups： model group, madopar group, Pingchan Potion (16,8,4 g/kg) group and com
5、bined group. In add ition, ten rats were in eluded in the no rmal control group. All rats were continually treated for 5 weeks. The rotational behavior of rats before and after treatment by apomorphine was observed. After 5 weeks, the number of tyrosine hydroxylase (TH) positive cells were detected
6、by immunohistochemical method, and dopamine ( DA ) and its metabolic products in nigrostriatal system of each group were determined by using high performanee liquid chromatography coupled to electrochemical detection (HPLC ECD). RESULTS： Compared with model group, the times of rats rotation were dec
7、reased respectively after 3 week treatment in the madopar group and combined group (P&It； 0. 05) ； the times of rats rotation didn t decrease in Pingchan Potion 16 g/kg and 8 g/kg group, but it did not change obviously in 4 g/kg group (P>； 0. 05) ； the times of rats rotation in model group increas
8、ed post treatmeat (P&It； 0. 05), and the behaviour of normal group didn t change. The number of TH positive cells in substantial nigra of ra/ts treated with Pingchan Potion 16 g/kg and 8 g/kg was higher than that of model group (P<； 0. 05), yet lower than that of normal group The levels of DA and
9、3,4 dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) in the rats of Pingchan Potion (16,8 g/kg) and madopar and combined groups were higher than that of the model group (P&It； 0. 05), but lower than that of normal group, the levels of DA and DOPAC in Pingchan Potion 4 g/kg group did not significantly change CONCL
10、USION： Pingchan Potion could partially improve the rotational behavior in PD model rats, and provide a protective effect against 6 OHDA induced neuronal death in parkinsonian model by reducing DA neuron loss and increasing DA content.Keywords】 Parkinson disease； pingchan Potion； rotational behavior
11、； tyrosine 3 monooxygenase ； dopamine0引言帕金森病（Parkinson s disease, PD）是中老年人 常见的神经系统变性疾病，其主要病理改变是中脑腹侧、特 别是黑质致密部多巴胺（DA）能神经元进行性变性缺失，导 致神经递质DA匮乏.由于PD的发病机制尚不清楚，临床治 疗仍以多巴制剂替代为主，但其长期应用会出现明显的副作 用或不同程度的药效减退，并可加速PD的自然病程1.平 颤颗粒为纯中药制剂，以往临床研究表明其能有效地改善PD 患者的运动症状和精神症状2,且未发现明显的毒副作用. 我们采用6務基多巴胺（6 0HDA）制备PD大鼠模型，观 察平颤颗
12、粒对PD模型鼠的行为及黑质DA能神经元的影响， 探讨其治疗PD的疗效机制，从而为临床应用提供用药依据.1材料和方法1.1材料 清洁级SD大鼠（第四军医大学实验动物中 心）88只，雄性，体质量180220 g, 23 mo龄；6龛基多 巴胺（6 OHDA），多巴胺（DA）标准品，阿朴吗啡（APO）,小 鼠抗酪氨酸軽化酶抗体（TH）均购自sigma公司；3,4二轻 基卞胺（DHBA ）,3,4 二務基苯乙酸（DOPAC ）购自 sigma aidrich公司；兔抗小鼠IgG, ABC试剂盒，DAB显 色剂（北京中杉公司）；美多芭片（上海罗氏制药有限公司, 批号：SH0436）；平颤颗粒（第四军医大
13、学西京医院药剂科, 批号：060904,方含何首乌、白芍、枸杞子、肉衣蓉、川苇 等中药，其中每克干粉含生药量6. 36 g.实验时用蒸馆水溶 解）；脑立体定位仪（日本Tokyo Narishige公司）；SM900冰 冻切片机（美国Leica公司）；LC 10A高效液相色谱仪； L ECD 6A电化学检测器（日本岛津公司）；C 18色谱分析 柱（46 mmX250 mm, 5 mm,安捷伦公司）；5810R型高速低 温离心机（美国Eppendorf公司）.1. 2方法1. 2. 1模型建立参照文献3的方法，用1 g/L戊 巴比妥钠腹腔注射麻醉.按大鼠脑立体定位图谱 （GeorgePaxinos
14、 & Charles Walson, 2005）定位.确定右侧 中脑两坐标：黑质致密部（SNC）：前囱后（5.20.1） mm, 矢状缝右侧（2.00.1） mm,颅骨下（8. 20. 1） mm；中脑 腹侧被盖区（VTA）定位坐标为:VTA：前囱后（4.80. 1） mm, 矢状缝右侧（1.00. 1） mm,颅骨下（8. 00. 1） mm.用 10 uL 微量注射器抽取新鲜配制的6 OHDA液5 uL （共10 ug, 溶于含1 g/L抗坏血酸的生理盐水中），以1 mL/min缓慢推 药，留针5 min,以1 mm/min缓慢退针.腹腔注射青霉素， 连续7 d.术后1 wk开始行为检测，
15、按0. 5 mg/kg腹腔注射 阿朴吗啡，观察其行为变化，连续测试2 wk,若大鼠恒定转向 左侧且旋转圈数6圈/min（240圈/40min）则视为造模成功, 同时注意观察是否伴有震颤、活动迟缓、抓握、嗅探等异常 行为.1.2.2动物分组及处理 将造模成功的大鼠随机分为 模型组、美多芭组、平颤颗粒高（16 g/kg）,中（8 g/kg）,低 （4 g/kg）剂量组以及联合用药组（美多芭用量为美多芭组量 的1/4,平颤颗粒为8 g/kg）,以正常大鼠为阴性对照组， 每组各10只，共7组.于每日09 ： 0010： 00对正常对照 组和模型组大鼠用蒸馆水2 mL灌胃，美多芭组用美多芭混 悬液2 m
16、L （含美多芭125 mg/kg,相当于临床等效剂量40 倍）灌胃，连续5 wk.1.2.3行为学检测分别于大鼠经灌胃处理后3, 4, 5 wk进行实验，腹腔注射阿朴吗啡0. 5 mg/kg诱发旋转，实验 过程同造模后的旋转实验鉴定，记录给药后40 min的旋转 次数.1.2.4免疫组化(IH)法检测TH阳性细胞数 行为学检 测完毕后将大鼠麻醉、开胸，动脉插管，以9 g/L生理盐水 冲洗血液，随后灌注含40 g/L多聚甲醛的0. 1 mol/L PB液, 4C,完整剥取脑组织，后固定，蔗糖内梯度脱水，取前囱后 4. 2-5. 5 mm范围作连续冰冻冠状切片，片厚40卩叽 将切 片入 0.01 mol/L PBS (pH7. 4)漂洗后，30 mL/L H202 溶液 (0.01 mol/L PBS稀释)处理10 min,漂洗3次，山羊血 清封闭，加小鼠抗THmAb(l : 800), 4C孵育48 h,漂洗3次, 入生物素化兔抗小鼠IgG(l : 200)室温孵育24 h,
