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1、赭曲霉毒素A快速检测方法研究进展及其在中药中的应用前景赭曲霉毒素A (OTA)是一类主要由曲霉属和青霉属等真菌 产生的次级代谢产物，具有强烈的肾毒性，致畸、致癌、致突变等作 用。研究表明OTA不仅广泛污染于食品饲料和农作物中，近年来在香 辛料、甘草等中草药中也被证实广泛存在。鉴于OTA的普遍性和危害 性，？文分别综述了可视化试纸条、流式微球技术、电化学传感器、表 面增强拉曼光谱等技术在OTA快速检测上的应用，预期为实现OTA检 测快速化、操作简单化、仪器小型化的高通量检测研宄和应用提供参 考。关键词赭曲霉毒素A;中药；快速检测方法Abstract Ochratoxin A (OTA) is a
2、 toxic secondarymetabolite mainly produced by Aspergillus and Penici 11iumspecies，with strong renal toxicity，teratogenic，carcinogenic， mutagenic effect. Studies have shown that OTA is not only widelycontaminated in Chinese herbal medicines such as spices，licorice and so on. In view of OTA s universa
3、lity andharmfulness, this paper summarizes the flow visualization teststrip, microsphere, electrochemical sensor, surface enhancedRaman spectroscopy technology in OTA rapid detection, whichprovides reference for the research and application of highthroughout detection instrument miniaturization in o
4、rder toachieve OTA quick detection and simple operation.Keywords ochratoxin A； Chinese medicine； rapid detectionmethod随着中药材出口逐年增加，我国中药材的安全问题也受到了全世 界的广泛关注。中药材安全问题除了其自身的内源性毒素，例如川乌 中的乌头碱、雷公藤中的雷公藤碱等外，真菌毒素、农药、重金属这 3大主要外源性污染物也严重威胁着中药材的安全性和品质。由于中 药材本身营养成分丰富和外部环境的影响，在种植、采收、加工、运 输和储藏过程中操作不当极易污染真菌，进而产生各种真菌毒素1
5、。真菌毒素是巾真菌产生的次级代谢产物，种类繁多，包括黄曲霉 毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、玉米赤霉燏酮等，其中赭曲霉毒素A (OTA)是由二氢异香豆素以酰胺键结合1个苯丙氨酸形成的苯基氨酰 衍生物，是赭曲霉毒素系列中毒性最强的真菌毒素，在二氢异香豆素 环上的氯原子可以增强毒性，脱氯的赭曲霉毒素B (OTB)其毒性要比OTA小10倍。OTA主要由纯绿青霉、赭曲霉和碳黑曲霉产生，不仅具 有致癌、致畸和致突变作用，还具有肝肾毒性、免疫毒性等，而且化 学性质稳定，只有在250 C以上温度加热数分钟才能降低OTA的浓度， 己被国际癌症研究中心（IARC）定义为II类致癌物质，这严重影响了 中药的质量和疗效
6、，对人类健康造成极火威胁，也阻碍其进出口贸易 和中药国际化和现代化进程，如欧盟规定辣椒、肉豆蔻、干姜、姜黄 及其混合物中OTA的限量为15 y g?kg-l,甘草根的浸溃物中OTA限 量为20 ug?kg-l,中国台湾对婴儿食品中OTA的限量标准为不得检 出2-6。1中药中赭曲霉毒素污染现状中药大多来源于自然界中的植物和动物，而产赭曲霉毒素A的霉 菌在自然界中具有广泛性。因此，中药也容易受到这些霉菌的侵害。 近年来随着中药在疾病预防与治疗、保健品、食品开发等方面重要性 的提高，中药中真菌毒素的污染也备受关注。为了保障中药、保健品 和食品等安全及人体健康，世界各国及相关组织十分重视真菌毒素的 检
7、测及其污染的控制。我国中药材品种繁多，资源丰富，就药典收录 的品种就有2 000余种，种植和加工技术有很大的差别，成分基质复 杂。近几年文献报道，OTA污染主要集中在根及根茎类、种子果实类 和芳香植物中等7-12，见表1。2基于抗体的快速检测方法基于抗体的快速检测是以抗体抗原免疫化学反应为基础，对抗体 抗原含量进行测定的一种方法，具有高度的特异性、灵敏度和快速简 便等优点。OTA相对分子质量为403. 82，属于半抗原，抗原性较弱，在免疫反应中，只具有反应原性而不具有免疫原性，因此只有与蛋白 质等大分子物质结合后，才具有免疫原性13。2.1胶体金免疫色谱技术胶体金免疫色谱技术（gold imm
8、unochromatography assay, GICA）是1种将单克隆抗体技术、胶 体金标记技术和免疫检测技术等多种方法存机结合在一起的固相标记 免疫检测技术。0TA快速检测试纸条应用了竞争抑制免疫层析的方法, 从加样处开始分别为样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸。对金标垫用处 理液进行处理然后喷上金标抗体进行偶联，NC膜的检测线（T线）为 偶联丫 BSA的0TA和控制线（C线）为羊抗鼠的二抗。赖卫华等14应用竞争抑制免疫层析的方法，研制出了 1种用于 快速检测赭曲霉毒素A的胶体金试纸条，其检测限为10 Pg?L-l，检 测时间为lOmin。该实验的结果研究表明，赭曲霉毒素A的结构类似 物赭曲
9、霉毒素B，桔霉素与赭曲霉毒素A快速检测试纸条不产中交叉 反应，表明赭曲霉毒素A快速检测试纸条具有较好的特异性。目前该 方法由于具有快速、操作简单、检测吋间短等特点，可用于大批次样 品的检测，其在食品和中药中的检测会得到充分发展和广阔应用。 3.2电化学适配体传感器技术在适配体技术的基础上，为了满足复杂 样品如食品、饲料和中药材中痕量目标物如农药、真菌毒素等检测需 求，就耍寻找到提高检测灵敏度的信号放大方法。由于金属纳米粒子 含右大量的金属离子，并且可以通过电化学的方法检测出来，根据这 一特性可以将金属纳米粒子作为放大检测信号的信号分子，选择具有 良好生物亲和性纳米材料作为基底或母体（如SiO2
10、纳米粒子等），将 多个活化后的另一种纳米材料（如CdS景子点、磁微球等）装载在经 修饰后的基底上形成复合型纳米材料，然后与sDNA反应后形成纳米信 号探针，将cDNA与金电极自组装形成捕获探针，将两者相结合形成电 化学生物传感器，利用免疫竞争原理和电化学工作站进行检测，就可 以定性定量检测超低含量的H标物，如食品、粮食和中药材中的赭曲 霉毒素A 33-35。在生物传感器的领域中，巾于纳米材料的介入，借助其在光学、 电学、磁学和化学活性等性能上的独特表现，使本身就基于纳米级别 分子运作的生物传感器能够更好的在小分子化合物检测上如虎添翼 36。Bonel等37将OTA特异性的适配体与磁微球反应孵化
11、成功能 化的磁球，利用磁场的磁力将修饰过的磁微球固定于丝网印刷电极上， 辣根过氧化物酶-OTA结合物与供试溶液中游离的OTA产生竞争反应， 反应的产物采用差示脉冲伏安法来测定，该方法在检测OTA上线性范 广，在0.788. 74 ug?L-l,且检测限能达到0.007 ug?L_l，在实际样品小麦中检测0TA含量，其结果的RSD小于8%，专属性强，与 同类毒素也不发生交叉反应。3. 3表面增强拉曼光谱技术表面增强拉曼光谱 （surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）技术是基于拉曼散 射效应，将待测分子吸附在某些经特殊化修饰、具有纳米结构特性的 金属表面
12、上，从而增强其拉曼散射效应的分子振动光谱技术38。该 技术不仅能提供待测分子的详细结构信息，而且对待测物的检测限理论上能达到单分子的水平，比常规的拉曼技术的灵敏度高出数个数量 级，从而能实现对痕量物质，尤其是中药材中的真菌毒素（如赭曲霉 毒素A等）的快速定量检测。为了减少复杂的基质效应，SERS的应用 主要是将贵金属纳米粒（如纳米金颗粒、纳米银颗粒等）与信标寡核 苷酸单链相结合，将该结合物作为SERS的信号增强基底，从而实现食 品等基质中存害小分子物质和真菌毒素的高灵敏检测3942 oGanbold等43用Cy5焚光染料标记OTA适配体，并吸附于纳米 银颗粒表面，增强了拉曼光谱信号，当环境体系
13、中存在OTA时，就会 与适配体结合发生结构转变，并使原先Cy5-OTA与纳米银颗粒之间的 化学键断裂，从而使拉曼光谱的信号强度下降。在浓度0.110 nmol?L-l，随着0TA浓度的上升，拉曼光谱的信号强度可以下降到40%。 此外他们还采用杀鼠灵作为对照组来验证该方法的抗干扰能力，结果 证明杀鼠灵不会干扰表面增强拉曼光谱的信号及强度。该方法的检测 限极低，能达到0. lnmol?L-l的水平，只需要极少的样品量和极短的 检测时间（30 s）就可测得0TA的含量，因此，这在中药材中0TA的现场实吋快速检测具有很大的应用前景。此外，表面增强拉曼光谱技术为中医药成分的鉴定提供了一种更为准确、客观、
14、直接的鉴定手段。李宁等44将表面拉曼光谱技术与 其他检测手段和数据处理方法结合后成功鉴别出了单味中医药的成 分、产地以及真伪，在中医药煎剂成分的鉴定中也体现出了其优越性。 表面增强拉曼光谱技术作为一种新的鉴定手段，在中医药鉴定方面存 着巨大的潜力，有望成为中医药鉴定的另一强大工具，见表34其他快速检测方法近红夕卜光谱成像(near-infrared hyperspectral imaging)是一种现代光谱技术，是将现代电子技术、光谱分析技术、计算机技术和 化学计量学技术相互结合的集合体45。近红外光谱成像是近年来发 展起来的一种新的分析手段，特别是在分析化学成分和污染物的空间 分布测定方面，
15、近红外图像技术具有实现快速、无损、原位、在线分 析的特点。通过近红外图像不但能够得到生物组织和化学成分的清晰 轮廓和分布信息，而且还可以通过化学计量学方法实现对特定目标成 分的定性和定量分析46。Senthilkumar T等47使用近红外(NIR)高光谱成像系统对储存的小麦中的白曲霉、青霉属感染和赭曲霉毒素A污染?M行检测研究。 每两周对真菌感染的样品进行成像，将从图像数据获得的三维超立方 体转换成二维数据。将主成分分析应用于二维数据并基于最高因子载 荷，1 280, 1 300, 1 350 nm被识别为有效波长。提取对应于有效波 长的6个统计特征和10个直方图特征，应用二次和马氏判别分类
16、器对 其进行线性测定。结果显示所有3个分类器从健康内核分离真菌感染 的内核分类准确度大于90%o二次判别分类器为成对，双向和六路分 类模型提供了比线性和马氏分类器更高的分类精度。赭曲霉毒素A污 染的样品除了对应于真菌感染的2个有效波长之外，在1 480 nm具有 独特的显著波长，仅在赭曲霉毒素A污染的样品中鉴定在1 480 mn 的峰。赭曲霉毒素A污染的样品可以使用NIR高光谱成像系统以100% 分类精度检测。NIR高光谱系统可以区分不同真菌感染阶段和储存小麦中不同水平的赭曲霉毒素A污染。近红外光谱技术以其速度快、操作简单、效率高、无污染和成本 低等特点，已被广泛应用于各个领域，它不但能分析与含氢基团直接 相关的有机物，而且在无机物的检测上也有很多成功实例，但是其作 用机理有待进一步研究。随着近红外光谱硬件设备成本的不断降低， 进一步完
