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1、蛋白质组学 概念蛋白质组是在一个细胞的整个生命过程中由基因组表达的以及表达后修饰的全部蛋白质；蛋白质组学是蛋白质组概念的延长；是蛋白质的规模化争论，从蛋白质水平和生命本质层次上争论和发觉生命活动的规律和重要生理，病理现象的本质，揭示基因活动的动态表达；蛋白质水平的分析不仅为生物分子体系供应最有效的实时分析模型而且也获得了DNA和RNA水平上不易获得的信息；争论内容蛋白质的争论内容主要有两方面：1，结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的争论，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析种类分析及数量确定;2，功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的争论，包括蛋白质功能及蛋白质间的相互作用；争论内容蛋白
2、质组学可分为三个主要领域：1，蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰；2，“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范畴的有力应用比较；3，应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法，生物质谱法）或酵母双杂交系统以及其他蛋白质组学争论新技术争论蛋白质-蛋白质相互作用；争论技术3蛋白质分别策略：1，多维色谱法，包括大小排阻色谱法，离子交换色谱法，反相高效色谱法，疏水性相互作用色谱法等；2，多维电泳技术，包括二维凝胶电泳法，自由流淌电泳法，毛细管区带电泳法等；3，亲合法，包括免疫印迹法，亲和捕获；4，细胞器，膜的复合体分别；二维凝胶电泳法：二维凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等
3、电点不同用等电聚焦分别，其次向就按分子量的不同用SDS-PAGE分别，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开；2-DE有较好的辨论率，SDS-PAGE或单相IEF的最好辨论率仅为100个蛋白，而2-DE大约为3000个蛋白；蛋白质肽段的鉴定:1，氨基和羧基末端分析，如：Edman2，质谱法，包括肽片段的质谱和串联质谱法，质谱法：质谱（massspectrum）是化合物分子在真空条件下受电子流的轰击或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带电荷的离子，这些离子按质荷比m/z（离子的质量m与其所带电荷z的比值）的大小被收集并记录程谱的方法；生物质
4、谱技术是蛋白质组学争论中最重要的鉴定技术，其基本原理是样品分子离子化后，依据不同离子之间的荷质比（M/E）的差异来分别并确定分子量；对于经过双向电泳分别的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽键）成肽段，对这些肽段用质谱进行鉴定与分析；目前常用的质谱包括两种：基质帮忙激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI-MS）；蛋白质相互作用1，免疫共沉淀技术：该技术以抗体和抗原之间的特异性结合为基础，不仅能够确定生理条件下细胞或组织内2种目标蛋白质是否存在相互作用，仍可以探究与己知相互作用的蛋白；它的基本原理是在非变性条件下裂解细胞，保留细胞内相互
5、作用的蛋白质，将目的蛋白的抗体加入细胞裂解液中，使目的蛋白在体内的相互作用蛋白成电下来；经过洗脱，收集沉淀物并进行分别，最终对分别所获得蛋白进行鉴定；该方法所争论的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可分别的自然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的蛋白质间相互作用蛋白质相互作用2，酵母双杂交系统：该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DNA结合结构域(bindingdomain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activationdomain,AD)启动所调剂的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待争论蛋白Y的基因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同
6、一酵母细胞中表达，生成两个融合蛋白；如蛋白X和Y可以相互作用，就AD和BD在空间上接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告基因;反之，假如X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达；这样，通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用；蛋白质相互作用3，蛋白质芯片技术蛋白质芯片是一种新型的生物芯片，能够进行高通量的蛋白功能分析；该技术实现的基础是蛋白探针在固相支持物(载体)表而的大规模集成，利用样品中标记或未经标记的靶蛋白分子与探针进行反应，然后通过荧光法，放射性同位素法或无标记检测法等相应的方法进行检测，最终由运算机分析结果，获得高丰度表达蛋白；蛋白质组
7、学的应用 疾病争论 植物学 药物争论 食品科学 遗传病学 微生物学在疾病及药物争论中的应用 1.发觉新的疾病标志物，鉴定疾病相关蛋白质作为早期临床诊断标志； 例如：Lei等通过2-DE和基质帮忙激光解析电离飞行时间质谱等蛋白质组学相关技术对膀胱癌患者的尿蛋白进行分别鉴定，获得14个差异表达的蛋白质，这些差异表达的蛋白可能是诊断和检测膀胱癌的潜在尿标志物；在疾病及药物争论中的应用 2.探究疾病的发病机制和治疗途径； 例：Polprasert等应用蛋白质组学方法对遗传性球形红细胞增多症的红细胞膜蛋白变化进行争论，分别鉴定出56个差异表达的蛋白质，通过蛋白质网络分析出包括细胞死亡，细胞循环及遗传性和
8、血液性紊乱3个HS相关的重要网络，为进一步争论和明白HS相关的发病机制供应了参考；在疾病及药物争论中的应用 3.争论膜蛋白及膜相关蛋白 Liu等利用比较膜蛋白组学方法对H5N1病毒分别感染6,12,14h的人肺腺癌细胞A549进行蛋白分析鉴定，得到24个差异表达的蛋白质，其中57%为膜蛋白或膜相关蛋白，通过siRNA技术鉴定出与病毒增殖相关的几种蛋白质；在疾病及药物争论中的应用 4，为快速，特异，高通量的药物争论供应了技术支持； Lin等应用蛋白质组学技术对阿霉素处理的人子宫癌细胞的蛋白表达变化进行争论发觉，有 37 种差异表达的蛋白质，为阿霉素抗性的子宫癌细胞的治疗供应了诊断和治疗标志物；蛋
9、白质组学的争论技术 蛋白质分别技术：双向凝胶电泳（2DE），双向荧光差异电泳（2D-DIGE），等电聚焦电泳（IEF）,液相色谱； 多维色谱（MDC），多维液相色谱（MDLC） 蛋白质鉴定技术 一级质谱：依据离子源的不同，分为基质帮忙激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI- MS）；二级质谱： 肽质量指纹图谱（PMF）； 新技术：稳固同位素特点标签生物质谱(SIAMS) iTRAQ 定义：同位素标记相对和确定定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技术由AB SCIEX公司
10、研发的一种体外同种同位素标记的相对与确定定量技术；该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量选择技术；原理：iTRAQ 技术接受4种或8种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或确定含量；iTRAQ试剂iTRAQ试剂是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：1.一端是报告部分reportergroup2.另一端是肽反应部分peptidereactivegroup3.中间部分是平稳部分balancegro
11、upreportergroup：质量为114Da，115Da，116Da，117Da，因此iTRAQ试剂共四种；peptidereactivegroup：将reportergroup与肽N端及赖氨酸侧链连接，几乎可以标记样本中全部蛋白质；balancegroup：质量为31Da，30Da，29Da，28Da，使得四种iTRAQ试剂分子量均为145Da，保证iTRAQ标记的同一肽段m/z相同；iTRAQ试剂结构iTRAQ试剂标记原理4个来源不同的相同蛋白样品在一级质谱上表现相同;Balancegroup在二级质谱发生中性丢失;Reportergroup在二级质谱产生个报告离子，分别是114，11
12、5，116和117;通过分析报告离子的峰强度比值就可以分析同一个蛋白在不同样品间的表达量比值.操作流程仪器TripleTOFTM5600+系统是快速评估药物代谢稳固性，药物在体内特点和最终代谢产物鉴定的抱负平台；在最快采集速度条件下，用高辨论和精确质量质谱数据，完成无与伦比的蛋白质定性鉴定工作；技术特点定量精确：每组平行比较多达8个样本，标记效率高达97%，可削减样本处理，以及不同组上机造成的试验误差；高效率样品分别：进行SCX-HPLC分别，实现自动化操作；高鉴定率：系统全面地争论组织或细胞中尽可能多的蛋白质，可鉴定多达6000种蛋白；适用范畴广：无物种特异性限制，理论上可用于全部物种；iT
13、RAQ技术不仅可发觉胞浆蛋白，仍有膜蛋白，核蛋白，胞外蛋白；仪器性能优良：基于高辨论率（大于105），高质量精度（小于1ppm）质谱平台，可获得更加精确的结果；iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白，强碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白；荧光差异凝胶电泳原理 在二维电泳的基础上进行荧光标记特点 DIGE荧光差异蛋白表达分析系统在传统双向电泳技术的基础上，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分别多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念，极大地提高了结果的精确性，牢靠性和重复性；在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件全自动依据每个蛋白点的内标对其表达量进行校
14、准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的；DIGE技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异，统计学可信度达到95%以上；试验流程仪器 荧光差异凝胶电泳系统Ettan DIGE 2D试剂1.样品标记（1）染料 Cy2,Cy3,Cy5 与蛋白的赖氨酸的epsilon-氨基反应，产生三种带正电荷的荧光基团，在不同波长光激发下产生荧光； 2.一相等点聚焦（2）IPG胶条水化液（3）分别胶缓冲液（4）平稳缓冲液（5） 溴酚蓝溶液 平稳缓冲液包括6M尿素和30%甘油，会削减电内渗，有利于蛋白从第一向到其次向的转移；第一步平稳在平稳液中加入DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于仍原状态；其次步平稳步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的DTT烷基化(银染过程中，DTT会导致点拖尾pointstreaking)；3.二相SDS-PAGE
