《生化第三版笔记完全版:第十四章RNA的生物合成》由会员分享,可在线阅读,更多相关《生化第三版笔记完全版:第十四章RNA的生物合成(15页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、第十四章 RNA的生物合成RNA的生物合成包括转录和RNA的复制。转录(transcription):以一段DNA的遗传信息为模板,在RNA聚合酶作用下,合成出对应的RNA的过程,或在DNA指导下合成RNA。转录产物:mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA除某些病毒基因组RNA外,绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物。转录研究的主要问题RNA聚合酶 转录过程 转录后加工 转录的调控是基本内容,是目前研究的焦点,转录调控是基因调控的核心。转录与DNA复制的异同:相同:要有模板,新链延伸方向53,碱基的加入严格遵循碱基配对原则。相异:复制需要引物,转录不需引物。 转录时,模板DNA的信息全
2、保留,复制时模板信息是半保留。 转录时,RNA聚合酶只有53聚合作用,无53及35外切活性。转录是基因表达的第一步,也是最关键的一步。基因表达的终产物:RNA 蛋白质转录过程涉及两个方面RNA合成的酶学过程RNA合成的起始信号和终止信号,即DNA分子上的特定序列。DNA正链:与mRNA序列相同的DNA链。 负链:与正链互补的DNA链。转录单位的起点核苷酸为+1,起点右边为下游(转录区),转录起点左侧为上游,用负数表示:-1,-2,-3。第一节 DNA指导的RNA合成(转录)RNA链的转录,起始于DNA模板的一个特定位点,并在另一位点终止,此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因(
3、真核),也可以是多个基因(原核)。基因的转录是有选择性的,细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变,将转录不同的基因。转录的起始由DNA上的启动子区控制,转录的终止由DNA上的终止子控制,转录是通过DNA指导的RNA聚合酶来实现的。一、 RNA聚合酶RNA合成的基本特征底物:NTP(ATP、GTP、CTP、UTP)RNA链生长方向:53不需引物需DNA模板反应:1、 E.coli RNA聚合酶(原核)E.coli和其它原核细胞一样,只有一种RNA聚合酶,合成各种RNA(mRNA、tRNA、rRNA)。一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子,在任一时刻,大部分聚合酶(5000左右)
4、正在参与RNA的合成,具体数量依生长条件而定。E.coli RNA聚合酶全酶|(holoenzyme)分子量46万Da,由六个亚基组成,2 ,另有两个Zn2+。无亚基的酶叫核心酶,核心酶只能使已开始合成的RNA链延长,而不具备起始合成活性,加入亚基后,全酶才具有起始合成RNA的能力,因此,亚基称为起始因子。E.coli RNA聚合酶各亚基的大小与功能:亚基亚基数分子量(KD)基因功能1160rpoC与模板DNA结合1150rpoB与核苷酸结合,起始和催化部位。170rpoD起始识别因子237rpoA与DNA上启动子结合19-不详不同的细菌,、亚基分子量变化不大,亚基分子量变化较大,44KD92
5、KD。亚基的功能:核心酶在DNA上滑动,亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数,增加停留时间,使聚合酶迅速找到启动子并与之结合,亚基本身无催化活性。不同的因子识别不同的启动子,从而表达不同的基因。不同的原核生物,都具有相同的核心酶,但亚基有所差别,这决定了原核基因表达的选择性。RNA聚合酶的催化活性:RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板,转录时DNA的双链结构部分解开,转录后DNA仍然保持双链的结构。P360 图20-1RNA聚合酶的活性中心核心酶覆盖60bp的DNA区域,其中解链部分17bp左右,RNA-DNA杂合链约12bp。纯的RNA聚合酶,在离体条件下可转录双链DNA,但在体内,DNA的
6、两条链中只有一条可用于转录,这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了亚基引起的。解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性,在酶的前端解螺旋,在后端以相反方向重新螺旋化,活体状况中,可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。37时,RNA聚合酶的聚合速度可达40100个核苷酸/秒2、 真核生物RNA聚合酶真核生物的转录机制要复杂得多,有三种细胞核内的RNA聚合酶:RNA聚合酶I转录rRNA,RNA聚合酶II转录mRNA,RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。这三种RNA聚合酶分子量都在50万左右,亚基数分别为6-15。P362 表20-3 真核生物RNA聚合酶的分类、分布及各自
7、的功能动物、植物、昆虫等不同来源的细胞,RNApol的活性都可被低浓度的-鹅膏蕈碱抑制,而RNApol不受抑制。动物RNApol受高浓度的-鹅膏蕈碱抑制,而酵母、昆虫的RNApol不受抑制。除了细胞核RNA聚合酶外,还分离到线粒体和叶绿体RNA聚合酶,它们的结构简单,能转录所有种类的RNA,类似于细菌RNA聚合酶。3、 噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶仅为一条分子量11KD的多肽链,这些聚合酶只需要识别噬菌体DNA的少数启动子,并无选择地与其作用,37时的聚合速度200nt/秒。二、 RNA聚合酶催化的转录过程(E.coli)P361 图20-21、 起始RNA聚合酶结合到DNA双链的特定部
8、位,局部解开双螺旋,第一个核苷酸掺入转录起始位点,从此开始RNA链的延伸。在新合成的RNA链的5末端,通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷(pppG或pppA),即合成的第一个底物是GTP或ATP。起始过程中,因子起关键作用,它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合,亚基与结合时,亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合,。正链:与mRNA序列相同的两、链。负链:模板链。转录起点是+1,上游是-1。2、 延长转录起始后,亚基释放,离开核心酶,使核心酶的亚基构象变化,与DNA模板亲和力下降,在DNA上移动速度加快,使RNA链不断延长。转录起始后,亚基便从全酶中解离出来,然后nusA亚基结合到核心酶上,
9、由nusA亚基识别序列序列。3、 终止RNA聚合酶到达转录终止点时,在终止辅助因子的帮助下,聚合反应停止,RNA链和聚合酶脱离DNA模板链,nusA又被亚基所取代。由此形成RNA聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。三、 启动子和转录因子启动子:RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。转录因子:RNA聚合酶在进行转录时,常需要一些辅助因子(蛋白质)参与作用,此类蛋白质统称为转录因子。足迹法和DNA测序法确定启动子的序列结构。P363(一) 原核启动子结构与功能分析比较上百种启动子序列,发现不同的启动子都存在保守的共同序列,包括RNA聚合酶识别位点和结合位点。(1)、 -1
10、0序列(Pribnow框)在转录起点上游大约-10处,有一个6bp的保守序列TATAAT,称Pribnow框。此段序列出现在-4到-13bp之间,每个位点的保守性在45%-100%。频度: T89 A89 T50 A65 A65 T100据预测,Pribnow框中,一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。目前认为,Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物,Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开,形成开放型起始结构,它是RNA聚合酶牢固的结合位点,是启动子的关键部位。RNA聚合酶的结合,诱导富含AT的Pribnow框的双链解开,然后进
11、一步扩大成17个核苷酸长度的泡状物,在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。(2)、 -35序列(Sexfama box)(识别区域)只含-10序列的DNA不能转录,在-10序列上游还有一个保守序列,其中心约在-35位置,称为-35序列,此序列为RNA酶的识别区域。各碱基出现频率如下:T85 T83 G81 A61 C69 A52 ,其中TTG十分保守。-35序列的功能:它是原核RNA聚合酶全酶依靠因子的初始识别位点。因此,-35序列对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。-35序列的核苷酸结构,在很大程度上决定了启动子的强度,RNA聚合酶易识别强的启动子。-35序列提供RNA聚合酶识别信
12、号,-10序列有助于DNA局部双链解开,启动子结构的不对称性决定了转录的方向。P364 图20-4 原核型启动子的结构(二) 真核启动子真核基因的转录十分复杂,对启动子的分析要比原核基因的困难得多。真核生物有三种RNA聚合酶:RNA聚合酶I、II、III,分别转录rRNA、mRNA、tRNA和小分子RNA,这三类聚合酶的启动子各有其结构特点。1、 RNA聚合酶的启动子RNA聚合酶的启动子有三个保守区:(1)、 TATA框(Hogness框)中心在-25至-30,长度7bp左右。碱基频率:T82 A97 A85 A63 (T37 )A83 A50(T37 )(全为A-T,少数含有一个G-C对)。
13、此序列功能:使DNA双链解开,并决定转录的起点位置,失去TATA框,转录将可能在许多位点上开始。TATA框的改变或缺失,直接影响DNA与酶的结合程度,会使转录起始点偏移,因此,TATA是绝大多数真核基因正确表达所必需的。由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构,同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离,决定了起始位点的正确选择。启动子特定序列和酶的正确结构,这两者把酶置于一种正确的构象中,决定了识别的正确性和转录起始的正确性。(2)、 CAAT框中心在-75处,9bp,共有序列GGT(G)CAATCT功能:与RNA聚合酶结合。(3)、 GC框在CAAT框上游,序列GGGCGG,与某些转录因子结
14、合。CAAT和GC框均为上游序列,对转录的起始频率有较大影响。2、 RNApol的启动子RNApol的启动子在转录区内部。P365图20-5 由RNA聚合酶III转录的三个基因的启动子四、 终止子和终止因子终止子:提供转录终止信号的一段DNA序列。终止因子:协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。有些终止子的作用可被特异的因子所阻止,使酶越过终止子继续转录,称为通读,这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。终止子位于已转录的序列中,DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。P366图20-61、 大肠杆菌中的两类终止子P366图20-6 所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个
15、回文结构,它转录出来的RNA可以形成一个颈环式的发荚结构。(1)、 不依赖于的终止子(简单终止子)简单终止子除具有发夹结构外,在终止点前有一寡聚U序列,回文对称区通常有一段富含GC的序列。寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。(2)、 依赖的终止子依赖的终止子,必需在因子存在时,才发生终止作用。终止点前无寡聚U序列,回文对称区不富含GC。因子是55KD的蛋白质,可水解三磷酸核苷。2、 抗终止作用通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。抗终止作用常见于某些噬菌体的时序控制。早期基因于后基因之间以终止子相隔开,通过抗终止作用可以打开后基因的表达。噬菌体前早期(immediate early)基因的产物N蛋白就是一种抗终止因子。它与RNA聚合酶作用使其在左右两