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1、河北北方学院毕业论文堆型艾美耳球虫鸡胚培养研究Studies on chick embryo of Eimeria acervulina culture学生：指导教师：院系：动物科技学院动物医学系专业：动植物检疫班级：动植物检疫木科班论文提交日期：2011年6月9日目录引言31. 1材料51. 1. 1实验动物51. 1.2试验虫株51. 13试验药品和试剂51.2方法51.2. 1卵囊的收集与纯化51.2.2子抱子制备51.2.3鸡胚接种51.2.4卵囊计数及收集62结果62.1鸡胚接种口龄62. 2鸡胚接种剂量63讨论7参考文献9致谢11堆型艾美耳球虫鸡胚培养研究魏亚然（河北北方学院动物科
2、技学院动物医学系）指导教师：李忠浩摘要：目的:建立堆型艾美耳球虫的鸡胚培养体系，为以后的研究作参考。方法:用堆型艾美耳球虫子泡子分别接种8-11日龄鸡胚以确定最佳接种日龄，用不同剂 量子饱子接种同一日龄鸡胚以确定最佳子饱子接种剂量。结果:用堆型艾美耳球虫子抱子接种9日龄的鸡胚，其卵囊产量和卵囊成熟率均为最高， 成熟率达99%;当每个鸡胚接种子饱子1 X10*个时，其卵囊产量最高。结论:本文通过对堆型艾美耳球虫的鸡胚接种日龄、子饱子接种剂量两方面因素的研究， 初步建立了堆型艾美耳球虫的鸡胚培养体系，为日后确定合适的接种日龄和接种剂 量提供可靠的数据。关键词：堆型艾美耳球虫鸡胚接种日龄接种剂量St
3、udies on chick embryo of Eimeria acervulina culture(Wei Ya-ran)(Veterinaiy Medicine,College of Animal Science and Technology, Northern University of Hebei)Guide Teacher:Li zhong haoAbstract： Objective: Establishing develop system of chick embryo of Eimeria acervulina as a reference for future resear
4、ch Methods: Vaccinating sporozoite of Eimeria acervulina to chick embryos which are 8-11 days old to determine the optimal vaccination age, vaccinating with different doses of sporozoite to the same day-old chick embryos to determine the best sporozoite vaccination doses.Results:.Resulrs showed that
5、 9-day-old chick embryos were the optimal inoculator with the highest yield and 99% maturation of oocysts.When IxlO4 sporozoites were injected into Each embryo, the highest yield of oocysts was obtained.Conclusion: With the research of the chicken embryos vaccination day and vaccination doses of Eim
6、eria acervulina , we can initially establish a system of chicken embryo cultivation of Eimeria acervulina that can supply reliable data for confirming the appropriate vaccination day and vaccination doses.Keywords： Eimeria acervulina chicken embryo vaccination day vaccination doses引言鸡球虫是一类寄生于鸡肠道的原虫，
7、具有很强的宿主特异性，难以在鸡以外的动物 体内传代。鸡球虫病是由艾美耳科艾美耳属的球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内引起的全球 性寄生虫病。主要侵害1040日龄的雏鸡，死亡率可达80%以上。成年鸡感染后虽不会 造成大批死亡，但影响个体生产性能，产蛋力下降，还会激发各种疾病。给养殖业带来 巨大的经济损失。鸡感染球虫的途径和方式是食入饱子化卵囊。卵囊是球虫发育的最终阶段，通常从 肠道或粪便中分离获得。鸡的堆型艾美尔球虫具有严格的宿主特异性和寄生部位选择性。 为了得到纯净的球虫卵囊，除对肠道或粪便中卵囊进行繁琐的分离纯化研究外，同肘进 行了球虫体外培养研究，并取得可喜进展。Long(1965)l，J首次报道
8、了堆型艾美耳球虫在鸡 胚中完成整个发育史。随后在19661973年间，Long和Shibaloval2J陆续报道了布什艾美 耳球虫、和缓艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫。早熟艾美耳球虫的子饱子或第二代裂殖子 接种鸡胚尿囊腔能发育至卵囊。吕文顺、赵开元等用鸡胚研究了脆弱艾美耳球虫的内 生性发育史，结果显示各期虫体的发育时间与鸡体内基本相似。从子泡子开始到产生次 代卵囊，完成全部内生性发育需要144小时。谢明权等用鸡胚连续繁殖柔嫩艾美耳球 虫24代，建立了柔嫩艾美耳球虫鸡胚适应株。鸡胚繁殖球虫的成功，不仅为研究球虫疫 苗和防治药物提供了新的技术平台，而且为开展球虫分子生物学所需实验材料提供了可 靠保证。
9、球虫的细胞培养始于1965年，Patton (1965)首次用柔嫩艾美耳球虫子泡子接种 于已建立的牛肾细胞系细胞和鹤鹑胚胎成纤维细胞系中，获得了第一代成熟裂殖体。细 胞培养开始成为研究球虫行为发育和抗球虫药的重要手段，并逐渐显示出其重要性及必 要性。1970年Turner和Box首次在禽细胞上培养麻雀的拉氏等饱球虫在原代鸡胚细胞和 金丝雀细胞上，拉氏等饱球虫至少发育了两个无性生殖阶段，但没有观察到有性生殖阶 段虫体回。Doran (1971)首次报道了柔嫩艾美耳球虫可在鸡原代肾细胞中完成整个生 活史发育，从子泡子接种发育到卵囊。Ryley等(1972)圆报道在鸡骨单层细胞中接种布 氏艾美耳球虫
10、(Eimeria brunetti)子饱子，可发育到第2代裂殖体阶段 Hofmann等(1990) 报道柔嫩艾美耳球虫子抱子在鸡原代肾细胞中发育成卵囊的改良培养方法，接种后24 h 添加含10%胎牛血清的Williams E培养基，168 h后再添加含2.5%胎牛血清的199培养 基，有利于从子泡子发育到卵囊。此外，幼地鼠肾细胞（BHK细胞）、牛肾细胞（MDBK 细胞）、鸡胚肾细胞、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM细胞）都可作为培养支持细胞。BHK细胞 和MDBK细胞是建株细胞，但在BHK细胞上，只有柔嫩艾美耳球虫能完成第一代裂殖 生殖，其它虫种及生活史的其它阶段不能利用这种细胞；而在MDBK细胞、鸡肾
11、细胞、 鸡胚肾细胞上，柔嫩艾美耳球虫能完成其生活史的全部发育阶段，但不易进行球虫发育 的定量分析。陈刚等（1998）时将布氏艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）子抱子分 别接种于鸡肾原代细胞，置4041 C恒温培养，观察到布氏艾美耳球虫的第二代裂殖体 和配子体，继续培养再无进一步发育；而巨型艾美耳球虫仅在培养76 h,见一似裂殖体 的小球体，继续培养再无进一步发育。宋翠萍等（1998）山报道，将柔嫩艾美耳球虫子 饱子接种于体外培养的鸡原代肾细胞，在MEM细胞形成培养液和MEM细胞维持培养 液组成的体外细胞培养系统中，能够发育到卵囊阶段。秦建华等（2000） I报道堆形艾
12、美耳球虫（E.acervulina）早熟减毒株裂殖了不能在鸡胚成纤维细胞和鸡胚肝细胞中继续 发育，但可在鸡胚小肠上皮细胞和雏鸡肾细胞上发育到卵囊阶段。目前只有柔嫩艾美耳 球虫能在多种原代细胞系（鸡肾细胞，鹤鹑肾细胞，火鸡肾细胞，鸡盲肠细胞，鸡肝细 胞，鸡胚细胞，鸡胚成纤维细胞）上最终发育为卵囊。迄今，尚未有更好的培养细胞型 作为鸡球虫培养支持细胞的报道。本文在成功建立柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美尔球虫鸡胚培养体系的基础上，进行了 堆型艾美耳球虫的鸡胚培养研究，探索了相关的培养条件，为建立完整的堆型艾美耳球 虫鸡胚培养体系奠定基础。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物 维鸡，购自山东某鸡场。出壳
13、后运回实验室，在严格消毒的无球虫环境 中饲养至2周龄，其用具、饲料等均经80C 2h处理。试验前检查维鸡粪便，确定 为无球虫感染。1. 1. 2实验虫株堆形艾美耳球虫纯种，由河北农大寄生虫实验室保存提供。1. 1.3试剂与药品肢蛋白酶、脱氧胆酸盐、次氯酸钠、重铭酸钾。1.2方法1. 2.1卵囊的收集与纯化将堆形艾美耳球虫饱子化卵囊,人工接种14 口龄无球虫维鸡，接种剂量为5 xlO,个 /羽，记录精确的接种时间，接种后在严格消毒的无球虫环境中饲养。8d后断颈处死，从 盲肠收集未泡子化卵囊，置于28P3 0 C培养箱中培养，进行泡子化。待卵囊完全泡子 化后，离心洗净重铭酸钾，加入终浓度为30%次
14、氯酸钠溶液，置冰浴上作用30 min, 4000 r/min,离心lOmin,并用灭菌的HBBS反复洗涤沉淀，除净残留的次氯酸钠,MacMaster板 计数后按每胚接种100UL悬液的量稀释后用。1.2.2子抱子制备在卵囊悬液中，加入等体积的灭菌处理的玻璃珠，在漩涡振荡器上剧烈振荡2 min,经 此处理后约有95%的泡子囊释出，将悬液连同玻璃珠一同倒入灭菌的漏斗中，负压抽滤，血 球计数板法计数饱子囊数后按每胚接种WOuLS液的量以PBS稀释后备用。为获取子抱 子,将上述处理后获得的饱子囊悬液在41 C水浴中预热2 min,在悬液中加入0. 75%的脱氧 胆酸盐(TDC)和0. 25%胰蛋白酶，
15、在41C水浴振荡孵育30 min左右，至镜检见95%以上的子 泡子释出，以漏斗负压抽滤收集纯化的子泡子，离心并以灭菌PBS反复洗涤去除脱氧胆酸 盐(TDC)和胰蛋白酶后，血球计数板法计数后同上进行稀释后备用。1. 2. 3鸡胚接种取811 口龄发育良好的鸡胚，经照蛋标出气室和接种部位(尿囊腔)的位置，用碘酒 和70 %酒精消毒气室及接种部位，以灭菌尖锥在气室正中及接种点各打一小孔，用1 mL 注射器向尿囊腔接入0.2 mL子泡子悬液，用熔好的石蜡封闭注射孔，竖立放置鸡胚，置于 37C培养箱中孵育。每天检查鸡胚的存活情况，记录死亡胚数。1. 2. 4卵囊收集及计数存活接种鸡胚啄壳(19 口龄)后
16、，收取胚体的尿囊膜于100 mL 2.5 %重铭酸钾溶液中, 用组织捣碎机搅碎,经纱网过滤后，取10 mL滤液,3 000 r/ min,离心10 min,弃去上清, 加入4mL饱和盐水，用麦氏虫卵计数板分别计卵囊数和成熟卵囊数，并确定平均每枚鸡胚 收取的卵囊数及成熟卵囊数。2结果2.1鸡胚接种日龄用堆形艾美耳球虫子饱子分别接种8 口龄、9 口龄、10 口龄、11 口龄鸡胚，接种 子饱子量为每胚0.2 mL, IxlO4个子饱子，每个日龄组10只鸡胚，共用胚数为40只。接种后置于37C恒温培养箱中培养，每天检查鸡胚的活动及死亡情况。其结果见表lo表1鸡胚接种日龄实验接种日龄接种胚数接种剂量存活胚数死亡率(
