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1、临床医学论文间充质干细胞在软骨组织工程中的应用【摘要】：间充质干细胞具冇高度自我更新能力，能够分化为各种类型的细胞。 近20年间充质细胞在软骨组织工程中得到应用，动物实验显示了良好的软骨修 复潜能，成为软骨组织工程的理想的细胞来源。组织工程和干细胞技术已经确定 为对软骨缺损有效的治疗方法，间充质干细胞有望在软骨组织工程中得到更广泛 的应用。本文对间充质干细胞的特性和在组织工程中的应用进行了综述。【关键词】间充质干细胞 骨性关节炎 组织工程 自体软骨细胞移植术Abstract ： Mesenchymal stem cells has an extensive proliferalive pote
2、ntial and an abi1ity to differentiate into various cel 1 types.In recent years,masenchymal stem cel 1s have been applied in cartilage tissue engineering and they have shown significant poteni tai for carriage repai r in animal model s,and are being used as an ideal cel 1 source in car Iilage t issue
3、 engineeringTissue engineering and stem cel 1 technologies have established themselves as approved approaches for cart ilage repai r and eventually wi11 be widely used in the clinical practive.This paper discusses the characteristics and the application of mesenchymal stem cel 1s in cart ilage t i s
4、sue engineering.Key words : mesenchymal stem cells; osteoarthritis; tissueengineering; autologous chondrocyte transplantation由于关节软骨的修复能力有限，软骨缺损的治疗存在巨大挑战。自体软骨细 胞移植术(autologous chondrocyte t ransplantat ion)是软骨组织工程中的一种 方法，目前治疗软骨缺损比较有效。软骨组织工程最常应用软骨细胞，由于存在 供区并发症、软骨细胞的去分化和生命周期有限等问题，近20年间充质干细胞 在结缔组织工程中得到应
5、用，成为理想的细胞来源。间充质细胞已经在动物模型 中显示了良好的软骨修复潜能。1自体软骨细胞移植术修复软骨缺损有效的方法是自体软骨细胞移植术(ACT)。这种手术方法于20 世纪80年代由瑞典学者报道，用于治疗骨性关节炎。应用ACT治疗的病人在全 世界已经超过20 000例。Peterson等1随访39年的结果显示病人的疼 痛明显减轻，切取的12个活检标本中有8个显示透明软骨特征，关节软骨修复 达到持久的修复效果，如果2年后植入物不失败 在38年的生存率接近100%。第2代自体软骨细胞移植术应用生物材料膜(例如双层I型胶原/皿型胶原 膜)代替骨膜瓣以固定塡充缺损部位的软骨细胞。目的是减少与使用骨
6、膜瓣相关 的骨膜反应例如骨膜肥大。第3代软骨细胞移植术是将软骨细胞在三维支架环境 中培养，构建成新的软骨样的组织后再移植修复软骨。应用ACT面临的主要问题包括供区部位的并发症，软骨细胞在体外扩增的去 分化导致植入体内后不能形成软骨，纤维软骨修复以及机械性能较差，关节的修 复部位整合不良等2。2间充质干细胞与组织工程成功的组织工程包括3部份：（1）能够提供合适的三维环境的支架；（2） 能够分化和保持特殊细胞表型的细胞；（3）添加合适的生物活性物质如生长因 子、细胞因子，作为细胞特异分化的合适的刺激。软骨组织工程面临的主要问题是获得有活力的和分化良好的软骨细胞。 间充质干细胞有软骨分化潜能，容易在
7、体外大量获取并扩增而不丟失分化能力， 是软骨再生的理想细胞来源。2.1间充质干细胞的来源、分离和特性间充质干细胞来源于中胚层，具有高度自我更新能力，与造血干细胞不同， 能够分化为各种类型的细胞，包括骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞，肌细胞，心肌 细胞和神经元。它在保持骨髓的动态平衡和调节造血细胞系和非造血细胞系的成 熟方面起着重要作用，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中。从骨髓，脐带血， 脂肪组织和外周血中能够分离出间充质干细胞涧充质干细胞占骨髓中有核细胞 总数的2%3%，容易从骨髓中分离出来，在体外扩增儿代而不丟失分化潜能3。间充质干细胞的主要特征是在体外条件下贴附在塑料上，体外培养扩增 呈成纤维
8、细胞形态，表达儿种粘附分子，间充质干细胞存在的标记物包括CD105， CD 73，CD 90，不表达CD 45，CD 34和其他造血干细胞标记物3,4。脐带 血是间充质干细胞的良好来源,脐带血来源的间充质干细胞能够分化为多种类型 细胞，例如内皮细胞，神经元，平滑肌细胞，脂肪细胞，成软骨细胞和成骨细胞5。脂肪也是间充质干细胞的丰富来源6，脂肪来源的间充质干细胞在体 外能够分化为不同系的细胞，包括脂肪系，软骨系，肌细胞系和成骨细胞系，与 骨髓来源的间充质干细胞相比成软骨细胞的能力低7。Wagner等8应用 含有22种细胞表面抗原标记物的仪器板的流式细胞计量术，发现从脂肪组织， 脐带血和骨髓中分离出
9、来的间充质干细胞的全部基因表达表型相同。用同样的方 法培养的来源于不同供体的间充质干细胞产生持续的和可重复的基因表达。外周 血分离出间充质干细胞数量很低，很难诱导分化为软骨细胞9。2.2间充质干细胞的诱导在体外间充质干细胞需要诱导才能分化为软骨细胞。这种诱导包括添加许多 不同的生长因子，分化因子，激素和细胞因子。主要的有转化生长因子(TGF/3 TGF-/33)，胰岛素样生长因子(IGF-1)，地塞米松，骨形态发生蛋白家族(BMPs) 等。在软骨细胞的软骨分化过程中涉及激活的一个主要的信号传导通路是裂原活 化蛋白激g(MAPKinase)iffi路，它能够刺激形成特异性的软骨形成转录因子 So
10、x9，在软骨细胞形成表型和功能方面起着重要作用。间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的细胞内的作用机制目前不是很清楚。 Louise A 10硏究在单层塑料或3D胶原GAG支架中由TGF/3 1和IGF1诱发 的信号传导通路，信号传导通路介导成休鼠来源的间充质干细胞向软骨分化。结 果表明在单层培养和在胶原GAG支架11的TGF- /3 1诱导的软骨分化111包括p38 途径，然而在单层培养中IGF-1诱导的软骨分化累及p38，ERK1/2和P13K。在 IGF1处理的间充质干细胞的细胞核内发现在Pl3K下游区的Akt(苏氨酸激酶)磷酸化和磷酸Akt累积。表明不同生长因子诱导的间充质干细胞向软骨分化
11、的 信号传导通路不同，但同种生长因子在二、三维环境中刺激分化吋细胞内的信号 通路是相似的。加入TGFB 1的诱导软骨分化可能通过smad3和B 蛋S( /3 -catenin)，以 及Wnt信号通路来介导，提高间充质干细胞的分化能力，同时抑制成脂肪和成骨11。使细胞分化成为软骨系必须上调，然而对于成熟的成人软骨 细胞，/3 -catenin能够朿U激软骨细胞月巴大和骨化 Hansoo Parka等13硏究 一个可注射的生物可降解的水凝胶复合物聚L醇延胡索酸(OPF)，包含兔骨髓间 充质干细胞和明胶微粒，并带有TGF/3 1。生物鉴定法显示DNA数量在各组间没 冇明显的不同，然而与对照组相比微粒
12、组糖胺聚糖冇明显的增加；软骨特异性U 型胶原和蛋白聚糖基因的表达明显增加并与TGF- /3 1浓度呈剂量依赖性改变。表 明兔间充质干细胞在培养期是有活力的并分化为软骨样细胞。Kcun Hong Pk等12将兔的间充质干细胞种植在混合的水凝胶中，加 入TGF- /3 3或基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)，判定生长因子对向软骨分化的 效果。在含有TGF-/33的水凝胶支架内，检测全部的胶原和聚氨基葡糖含量最高， 增殖率和产生软骨特异性的细胞外基质比bFGF组明显增高。这表明加有TGF/3 3的细胞数量增加并保持细胞表型。A.H.Huang等14确定负载软骨细胞和间充质干细胞的水凝胶构建物在化
13、学培养基内培养加入TGF-B3时，能否达到正常的组织的抗张力性质，细胞负载 琼脂糖水凝胶构建物作分光特性并在化学的无血清培养基内培养。细胞浓集口拉 伸率提高并且保持在300400 kPa的水平，最终的紧张度和韧性增加，通过免 疫组织化学染色方法D型胶原沉积明显增加。动物实验已经显示TGF/3 3能促 进间充质干细胞向软骨分化21,23。Lorenz U等15将人间充质干细胞种植在可控制的释放IGF-1丝纤蛋白(SF)支架内，将支架放在含TGF/3 1补给性培养基内。在支架内第2周发现人间 充质干细胞的软骨分化，第3周最明显，在不负载的控制组支架内没冇观察到软 骨分化。表明IGF-1在多孔SF支
14、架内具有刺激人间充质干细胞向软骨分化的潜 能。地塞米松是一种合成的糖皮质激素，能够直接与糖皮质激素受体结合诱导软 骨分化，是一种强有力的软骨分化的刺激物，并口能够加强TGF/3的作用16。BMPs属于TGF,超家族，能诱导软骨形成，尤其是BMP-7 17，BMP-2、 TGF-13联合应用或者BMP-6和TGF- B联合应用能够促进软骨分化。然而单独使 用BMP-2诱导成骨细胞形成17。BMP-2、TGF- /3合用通过Wnt信号传导通路 上调Wnt 3a、/3-catenin 然后诱导产生Sox9和软骨形成。Hanna Taipaleenm ki等18通过抑制造血细胞生长，分离贴附的老鼠来源
15、的间充质干细胞， 可以快速的去除CD34、CD45阳性表达细胞，以生产出短期选择(STS)细胞。进一 步传代更富集的、更原始的、均一的Seal表迖的长期的选择(LTS)细胞。应用几 种BMP诱导微球培养的间充质干细胞向软骨细胞分化。在STS细胞，软骨分化迸 展很快，在STS细胞rhBMP2和7支持快速的软骨分化和终未分化，强于rhBMP6。在LTS细胞，rhBMP同源二聚体2，4，6，和rhBMP异源二聚体2/7是有效 的软骨分化的强化因子，强T rhBMP5，7 2.3构建组织工程软骨间充质细胞已经与各种生物支架技术联合应用，在动物模型中显示了艮好的 软骨修复潜能。王文良等19以骨髓间充质干
16、细胞为种子细胞，运舟纤维蛋白 胶种植技术，以双层壳聚糖（CS）/疑基磷灰石（HA）复合支架为载休，修复兔骨软 骨缺损，结果显示基本修复软骨缺损，骨缺损有骨小梁长入，改良Wakitani评 分优于对照组。S丄ken等20从11个新西兰大鼠的后侧骼皤获取骨髓间充质干细胞，在自体血清中培养28 d并在移植前24 h转移至透明质烷支架内。 在双侧膝关节的内侧髀制造4 mm直径和1.5mm深的缺损，在一侧膝关节植入含 有间充质干细胞的支架，对侧膝关节只植入支架。24周后处死兔子，组织学可 以观察到缺损处高度的塡充，两组间没有明显的不同燃而在间充质干细胞处理 组有更好的修复质量的趋势，没有形成肥大细胞。Mrugala D等21从绵羊骨 髓中分离间充质干细胞，扩增，并鉴定，在后腿的濮骨内侧制造部分厚度的软骨 缺损，
