植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定, 病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段一） 分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部 位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可 能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样病、健交接处，除材料新鲜，污染 的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功二） 分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法 和稀释分离法两种I. 组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离A:分离前的准备工作：1. 工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌 室和无萌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70% 酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾若用紫外线灯照射则需20-30分钟）在 没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空 气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果工作前擦净桌面，最好铺上湿 纱布将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿 上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1 %新洁尔灭擦手。
2. 分离用具的消毒凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、保、针等）都要随时（至少在使用时） 保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3 次（刀、剪、镶等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）再次使用时必须重复灭菌 培养皿、试验等要经过干热灭菌培养基及洗涤或稀释用蒸保水都需要事先经过 高压蒸气灭菌3. 分离材料的选择用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，E以减少腐生菌的污染任何 植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应 从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料B、植物病原菌的分离I.叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离：首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作：%1 培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将 溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平 板为防止细菌污染，倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴）1 病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下（若为 枝干，则将带有病斑的皮层剥下，但）1 取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1 %升汞液适量作表面 消毒一分钟，或用1%漂白粉消毒均可。
1 消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3,最后一次无菌水不要倒掉1 用灭菌锲，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组 织均应为病健相间组织用灭菌镶子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻 按压每皿4——5块，排放均匀1 用蜡笔在培养皿上注明分离代号，日期、姓名，将培养皿翻转放置于 23—25 C%1 3一 口后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落辿缘用 移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜而培养基中央，于25C温箱中 培养2, 稀释分离法：稀释分离法适用于细菌、土壤菌及产生饱子多的真菌等病原菌的分离 以白菜软腐病为例白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病组织接种健康菜帮上，经数次 转种予以纯化，其纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，再用无菌水洗三次，切 成适当大小，放在15厘米直径的培养皿中，菜帮下衬以吸水纸保温用无菌解剖 刀挑取病组织少许抹在菜帮的人为伤口上，培养在20—25C下，经1天左右呈现腐 烂，如此反复转种几次，至病斑纯净为止分离时，在新的水烂斑边缘挑取少量病组织在无菌水试管中配成菌悬液，取 灭菌培养皿3付，标好次序，其内各置无菌水1毫升，用移置环移 取菌悬液一 环，放在第1皿水中混合均匀，从中挑取一环稀释液至第2皿，再以同法稀释成第3 皿，取熔化后冷至45C左右的（一般将化好的培养基瓶靠近鼻尖，以不烫为度）牛 肉膏蛋白腺培养基，每皿倒约15亳升，沿着桌面轻轻摇匀，凝固后倒置于26-28C 的温箱中培养，1—2日后可见白色，圆形或近圆形直径为1—2毫米的菌落，从中 选典型菌落用移植环（划线法）移入牛肉膏蛋白月东斜面培养基上培养，每组转4—5 管，注意过早出现的大型菌落多为腐生细菌。
以上分离实验也可以划线法进行，方法是先取两付灭菌培养皿，每皿倒入约 15毫升熔化的牛肉膏蛋白腺培养基，沿桌面轻轻摇匀，制成平板，然后用移置环 沾取一环稀释好的菌悬液，在第一个培养皿平面培养基的左方长方形区内划平行 线5—7条，再以此移置环继续向右（和左方小区内的儿条平行线成一定角度）划 5_7条平行线，依此法划两皿，倒置于26-28C温箱中培养，1—2日后挑单个典 型菌落移到斜面培养基上，培养待用。