复发性流产患者外周血调节性T细胞检测及临床意义

《复发性流产患者外周血调节性T细胞检测及临床意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《复发性流产患者外周血调节性T细胞检测及临床意义（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、复发性流产患者外周血调节性T细胞检测及临床意义作者：李成，张强 单位：【摘要】目的探讨不明原因复发性流产患者外周血以 CD4+CD25high-intCD1271owTreg(CD4+CD25high-intCD1271owT regular cells)为代表的调节性T细胞表达及其意义。方法采 用三色荧光抗体标记及流式细胞术分析20例不明原因复发性流 产患者、正常妊娠组和正常非孕对照组外周血 CD4+CD25high-intCD1271owTreg 占 CD4+T 淋巴细胞的比例。结 果正常孕妇外周血CD4+CD25high-intCD1271owTreg较正常对 照组差异有统计学意义(P&

2、lt;0.01),复发性流产患者 CD4+CD25high-intCD1271owTreg调节性T细胞较正常对照组差 异有统计学意义(P<0.01),正常孕妇组较复发性流产患者组 差别则更显著；其中流产次数小于或等于3次的患者与流产次数 大于或等于 4 次的患者其外周血 CD4+CD25high-intCD1271owTreg 占 CD4+T 细胞百分比差异无统 计学意义(P>；o. 05) o经论 原因不明复发性流产患者外周血中 调节T细胞比例降低，这种改变导致原因不明复发性流产患者细 胞免疫耐受被打破，可能是原因不明复发性流产患者发病的重要 原因之一。【关键词】复发性流产；调节性

3、T细胞；流式细胞术 Significance of measurement of regulation T cells in peripheral blood of patients with recurrent spontaneous abortion Li Cheng, Zhang Qiang Department of Clinical Laboratory, Bengbu Second Peoples s Hospital, Bengbu 233000 Abstract Objective To investigate the expression andsignificanceofC

4、D4+CD25high-intCD1271owTreg(CD4+CD25high-intCD1271owT Regular Cells) in the peripheral blood(PB) from patients with unexplained recurrent spontaneous abortion(URSA),to explore the mechanism of autoimmune intolerance in URSA. MethodsTheproportionofCD4+CD25high-intCD1271owTreg in the PB of three group

5、s of people (URSA patients that they had been diagnosed clearly, normal non-pregnant women and the normal pregnant woman) analyzed by triad colour fluorescelabeled monoclonal antibody and using multiparameter flow cytometry. Results The proportion of CD4+CD25high-intCD1271owTreg/T CD4+ cells in the

6、normal pregnant woman was significantly higher htan those in control group(P<0. 01); the proportion ofCD4+CD25h i gh-i ntCD1271owTreg/T CD4+ cells in URSA patients was significantly lower than those in control group(P<:0. 01). Conclusion The percentages of CD4+CD25high-intCD1271owTreg was decre

7、ased, which break down the autoimmune tolerance in URSA, these changes of CD4+CD25high-intCD1271owTreg in number might participate in onset of URSA, it may be correlated to pathogenesis of URSA.Key words Recurrent spontaneous abortion;Regulatory T cell: Flow cytometry近代生殖免疫学研究认为，正常妊娠是一个类似于同种异体移 植的复杂

8、生理过程，并逐步认识到胚胎携带1/2有异于母体的组 织抗原，然而不被母体免疫系统排斥的实质是依赖于母胎之间的 免疫耐受关系，这一耐受一旦失调，从而导致母胎免疫失衡，将 可能发生包括原因不明复发性流产在内的病理妊娠，其中多因母 体对胚胎的免疫排斥所致多见。调节性T细胞是一群重要的具有 免疫抑制功能的T细胞亚群，能抑制CD4+、CD8+等T细胞活化 及增殖，它在防止自身免疫性疾病的发生、诱导移植耐受等方面 发挥重要的作用。而调节性T细胞中又以 CD4+CD25high-intCD1271owTregT 最具代表性1。因此本研究 拟采用三色免疫荧光标记技术和流式细胞术来检测以 CD4+CD25hig

9、h-intCD 1271 owTreg为代表的调节性T细胞在患者 外周血中变化及其临床意义。1资料与方法1. 1试验对象正常非孕组：正常妇女，15例，年龄2333岁,平均29. 7 岁，系来我院体检的正常健康妇女。排除全身系统性疾病，无生 殖道畸形、生殖道器质性及免疫相关性疾病，月经周期规律，既 往无自然流产史，采集外周血，肝素抗凝。正常妊娠组：正常妊 娠妇女10名，妊娠611周，年龄2436岁，平均29. 5岁， 其他条件同上，正常妊娠来我院做正常检查的，征得本人同意后 采集外周血，肝素抗凝。复发性流产组：20例，为2006年7月 至2008年4月就诊于我院门诊的患者，年龄2336岁，平均

10、28.4岁，自然流产次数≥3次，按常规进行病因筛查，排除染 色体、解剖结构、内分泌等方面的异常及感染，排除自身免疫性 疾病等，采集外周血，肝素抗凝。1. 2主要试剂与仪器小鼠抗人CD25-FITC、CD127-PE, CD4-APC及同型无关对照 均为美国Bechman-coulter公司产品。EPICS-XLII型流式细胞 仪购自美国Bechman-coulter公司1.3方法1.3.1样本采集及处理所有受试对象抽取静脉血2川1,均用肝素钠抗凝，5 h内用 流式细胞仪分析。1. 3. 2流式细胞仪分析取抗凝全血100 μ 1,分别加入APC标记的CD4抗体，FITC 标记的CD2

11、5抗体各20 PE标记的CD127抗体5 平行设3管同型对照。室温下避光孵育30 min,加溶血剂10 min, 振荡混匀，PBS洗2次，加入400 μlPBS重新浮悬细胞，流 式细胞仪分析，并算出 CD4+CD25high-intCD1271owTreg 占 CD4 淋巴细胞百分比。1.4统计学处理采用SPSS 11. 0统计软件分析，采用单因素方差分析及t检 验分析数据，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果正常非孕组，正常妊娠组及复发性流产患者外周血中 CD4+CD25high-intCD1271owTreg 调节性 T 细胞占 CD4+T 百分比 结果见表lo正常非孕组C

12、D4+CD25high-intCD1271owTreg调节 性T细胞较正常妊娠组差异有统计学意义（P0. 05 ）,见表2 o表2复发性流产患者流产次数与 CD4+CD25high-int 略）3讨论正常妊娠类似于同种异体移植，作为同种移植物的胚胎在母体 内存活直至分娩，实际上反映了母体对胚胎的免疫耐受，而妊娠 失败多因母体对胚胎的免疫排斥所致，人类自然流产的发病率高 达30%以上，对于自然流产连续发生3次或3次以上的反复自然 流产的研究显示，80%以上与妊娠期免疫功能调节紊乱密切相关, 而其中相当一部分与母胎免疫耐受机制紊乱有关。现在认为，免 疫耐受的维持（特别是外周免疫耐受的维持）可以通过

13、自我干预 的免疫调节机制即通过调节性T细胞有效抑制同种异体反应性 细胞介导的免疫反应而实现2。Sakaguchi等于1995年首次发现并报道小鼠和人的外周血及脾 脏组织的CD4+T细胞中有一群细胞持续高表达CD25分子（IL-2 受体α链），并将此类细胞命名为CD4+CD25+T调节性细胞, 简称为 CD4+CD25+Treg （CD4+CD25+T regular cells）,这种 CD4+CD25+Treg具有在体外呈低反应性，并具有抑制CD4+CD25 CD8+等效应性免疫细胞的反应性活化与增殖30随着研究的逐 步深入，认识到该型细胞除与控制自身免疫性疾病的发生、发展 密切

14、相关外，而且在维持自身免疫耐受及调节适应性免疫应答中 也发挥重要作用4。近年来研究还显示小鼠CD25表达的荧光 强度比较均匀一致，CD4+CD25+T细胞群基本上代表着调节性T 细胞，而人CD25+T细胞与CD25T细胞群无明显隔离，呈连续分 布，其中CD25强阳性的CD4T+细胞(CD4+CD25high)绝大多数为 特异的CD4+调节性细胞，而中等及弱阳性的CD4+T细胞 (CD4+CD25int-low)混杂有相当数量的I帷本内外各种信号刺激 后活化的效应性T细胞4。因此在人类CD4+CD25+双标记并不 能真实反映机体内CD4+Treg细胞的数量。研究还显示FoxP3可 能是调节性T细

15、胞最特异的标记物5、6,而且我们目前在基 因水平及蛋白水平上均检测到单细胞内FoxP3的表达7。但 FoxP3蛋白是一种细胞内蛋白，需要对细胞进行固定及穿孔后才 能鉴定，因此不能用来对活的CD4+Treg细胞纯化及其在相关免 疫性疾病发病机制中的研究。最新研究发现作为IL-7受体 α链的CD127在Treg细胞上为弱表达(CD1271ow)，但在 活化T细胞为高表达(CD127high) 8,所有的人调节性T细胞 均存在于CD4+CD25high-intCD1271ow群体内，该发现对精确检 测机体内Treg细胞具有突破性重要价值，利用CD4、CD25抗原 结合CD127三标记法检测CD4+Treg细胞既可排除活化的 CD25int-lowT效应性细胞的干扰，又可以避免检测细胞核内 FoxP3时必须灭活细胞缺陷，能特异性地识别调节性T细胞1。因此本研究将CD4、CD25低CD127三者结合检测以 CD4+CD25high-intCD 1271 owTreg T为代表的调节性T细胞在原 因不明的复发性流