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1、基因芯片医学探究意义1、基因芯片技术的发展概况基因芯片(genechip),又称DNA芯片，是指将许多特 定的寡核昔酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定 于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理 进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫 描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和 检测，从而迅速得出所要的信息1。近年来该技术又常被 称作DNA微阵列(DNAmicroarray)或DNA微阵列芯片，也称 为生物芯片(biologicalchiporbiochip),但生物芯片还包 括正在研制的蛋白质或肽芯片、组织原位芯片等类型。从广 义上讲，一切以芯片为基
2、础的生物分析过程均可称为生物芯 片技术，其中以大规模DNA杂交技术为基础的芯片技术尤为 人们所瞩目。1.1基因芯片技术产生的背景过去十余年里，随着人 类基因组计划(HGP)的逐步实施以及分子生物学相关学科的 迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定。 在GenBank数据库中已含有300万个序列，总数超过22亿 个碱基对，其中包括19种不同生物体的完整序列、近9000 个已知功能或已推测功能的人类基因序列。目前基因序列数 据库正在以前所未有的速度迅速增长。然而如何充分利用新 序列信息资源，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在 生命过程中所担负的功能，成为生命科学工作者的共同课 题
3、。已建立的诸如North-ern印迹、RNA酶保护实验、S1核 酸酶分析、噬斑杂交以及狭线印迹等方法不能提供足够通量 来有效地利用新的基因组学的资源。为此，必须发展高通量 (highthroughout)或平行监测基因表达的新方法。基因芯片 技术正是在这样的背景下应运而生。早在80年代初期，有 人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类 基因大量的遗传信息进行分析和检查。但直到1994年Pease 等人创造的光导原位合成(light-directedsynthesis)高 密、微化的寡核昔酸阵列(0DTA)的制作技术问世之后，才使 该设想逐步成为现实。因此可以说光导0DTA化学合成法，
4、 为DNA芯片技术奠定了基础。在DNA芯片获得突破之后，又建立了通过高速机器人 (high-speedrobotics)将cDNA定位排列到支持物上的cDNA 微阵列技术，产生了基因表达芯片，成为大规模研究基因功 能的强有力手段。1997年Jones建立了 “重述DNA测序 法v (iterativeDNAsequencingmethod),通过使用 Ils 类限 制性内切酶和含有Ils类RE识别区域的接合器，突破了 DNA 芯片只能分析单链DNA的限制，而可同时对多条双链DNA直 接进行平行测序。基因芯片的发展与双色荧光探针杂交系统 (two-colorf luorescentprobehy
5、bridization)的建 立有密 切关系。将两个不同样品的mRNA在反转录时用不同的荧光 底物进行标记。两组样品的cDNA混合后进行杂交。对同一 个探针位点，在两组不同的激发光下进行检测，获得该位点 上两个不同样品的杂交信号，其比值经阳性对照(外参照)比 值和组成型表达基因(内参照)比值的校正后，就是该基因在 两个不同样品中差异性表达的比值。这类系统可以很好地克 服检测过程中某些不稳定或不确定因素带来的不利影响，使 差异性表达的研究高效而可靠2, 3。在此基础上，近年来 各色荧光标记底物也已不断出现。1.2基因芯片的主要类型基因芯片的类型视分类方法 不同可分为不同的类型。1.2.1无机片基
6、和有机合成物片基的基因芯片以基因 芯片的片基或支持物(substrateorsupportmatrix)的不同 可以分为无机片基和有机合成物片基，前者主要有半导体硅 片和玻璃片等，其上的探针主要以原位聚合的方法合成；后 者主要有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜，其上的探针主要 是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基 o另有以聚丙烯膜支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合 成高密度探针序列。1.2.2原位合成和预先合成然后点样的基因芯片以探 针阵列的形式分为原位合成(insitusyn-thesis)与预先合 成然后点样(off-chipDNAsynthe-sis)两种。芯片制备的原 理是利
7、用照相平板印刷技术(photolithography)将探针排 列的序列即阵列图“印到支持物上，在这些阵列点上结合 上专一的化学基因。原位合成主要是指光引导合成技术，该 技术是照相平板印刷技术与固相合成技术、计算机技术以及 分子生物学等多学科相互渗透的结果。照相平板印刷中可用 光引导形成电子线路(electricalcir-cuits),利用类似的 原理可在固相支持物上同时合成出大量不同的化合物。预先 合成然后点样法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作 用传统的DNA合成仪进行。合成后再用特殊的点样装置或仪 器(如美国的 CartesionTechnologies 公司的 PixSysNQ/
8、PA 系列产品)将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过处理的 玻片上，点阵密度可达到3× ； 104spots/cm2。1. 2. 3基因表达芯片和DNA测序芯片根据芯片的功能 可分为基因表达芯片或基因表达微阵列 (geneexpressionmicroarry)和 DNA 测序芯片或重述 DNA 测 序芯片(interativeDNAsequencingchip)两类。前者可以将 克隆到的成千上万个基因特异的探针或其cDNA片段固定在 一块DNA芯片上，对来源于不同的个体(正常人与患者)、组 织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激(包括不 同诱导、不同治疗手段)下的细胞内mRN
9、A或反转录后产生的 cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特 异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺 激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与 疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确定，同时可进 一步研究基因与基因间相互作用的关系。DNA测序芯片则是 基于杂交测序(sequencingbyhybridization, SBH)发展起来 的。SBH的原理是，任何线状的单链DNA或RNA序列均可分 解成一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核昔酸，又称亚序 列(subsequence),如由8个核昔酸组成的8体亚序列。例如，可以把序列TTAGCTCATATG分
10、解为5个错开一个碱基而重叠7个碱基的8体亚序列(也可分为7体、9体或 其他整数n体的亚序列)。假如我们能把原序列所有这些错 落重叠的8体亚序列全部检测出来，就可据此重新组建出原 序列。对于一个未知DNA序列，可以用人工合成的、已知序 列的所有可能的n体寡核普酸探针与之杂交(在8体寡核昔 酸中，G, C, T, A4者自由组合而成所有可能的序列共有 48=65536种)。通过对杂交的检测，检出所有能与靶DNA杂 交的寡核昔酸，从而获知靶DNA中的所有8体序列，组合分 析后者，即可重构靶DNA的序列。如前所述，重述DNA测序 法的建立已克服了 SBH只能测定单链和二级结构对SBH的限 制。Affy
11、metrix公司的测序芯片,即是将65536个8nt的寡 核昔酸通过光刻的方法在芯片表面原位合成，获得一个微阵 列矩阵，分辨率为50&mu；mo而Chee等则将1. 35×； 105 个长度为15nt的寡核昔酸探针固定在芯片上，对长度为 16. 6kb的整个人线粒体基因组进行序列测定，每个检测位点 包括一套4个探针。芯片分辨率为35&mu；m,测序精度为99%。 另外也可根据所用探针的类型不同分为cDNA微阵列(或cDNA 微阵列芯片)和寡核昔酸阵列(或芯片)，根据应用领域不同 而制备的专用芯片如毒理学芯片(Toxchip).病毒检测芯片 (如肝炎病毒检测芯片)、P53基因检测芯片等
12、。1.3芯片杂交的检测方法对于以核酸杂交为原理的检 测的主要过程为：首先用荧光素标记经扩增(也可用其他放 大技术)的序列或样品，然后再与芯片上的探针进行杂交后 冲洗。图像的分析用落射荧光显微镜 (epifluorescencemicroscope),或电荷偶联装置照相机 (charge-coupl eddevi cecamera)、非共聚焦激光扫描仪 (nonconfocal laserscanner)等进行。目前应用较多的是美 国GeneralScanning公司开发的基因芯片专用检测系统 (ScanArray3000),采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号 采集，由计算机处理荧光信号，并对每
13、个点的荧光强度数字 化后进行分析。近期又开发出了 ScanArray5000o2、在医学研究中的意义2. 1特异性相关基因的克隆寻找和鉴定疾病相关基因 是从分子水平上研究疾病，揭示发病机制的一项重要基础性 研究工作，利用基因芯片进行新基因克隆时，固定在芯片上 的探针是某些cDNA文库内的cDNA片段。研究这些cDNA片 段对应基因的差异性表达，就可能选到差异表达相关基因。 如Schena等通过双色差示表达系统，研究人T淋巴细胞在 热休克条件下和佛波酯作用下1046个未知序列的cDNA基因 诱导表达的情况，并对诱导表达的cDNA进行测序，再与已 知基因进行比较。结果发现，热休克诱导了已知的热休克
14、蛋 白基因的表达，其中包括分子伴侣和分子降解的中间体。同 样，佛波酯引起了佛波酯调节基因的信号传导途径特征基因 的表达，如激活细胞的磷酸酯酶和细胞因子&kappa；Bl等。 另外，还发现3个低表达的已知基因和4个低表达的新基因 可能与该途径有关4。2.2基因功能的研究研究基因功能，确定基因与基因 间的相互关系，从而揭示疾病发生、发展的分子机制是医学 研究的重要内容，也是基因表达芯片最重要的用途之一。 Heller等采用基因表达芯片研究了类风湿关节炎、肠炎基因 的特征性表达活性。分别用cyanine3(cyt3)和cyt5对类风 湿关节炎组织和肠炎粘膜的cDNA进行标记后，与这两种疾 病发生过程
15、中目前已知可能起作用的基因阵列进行杂交，发 现已知炎症相关基因，如肿瘤坏死因子、白介素和粒细胞集 落刺激因子在组织中有表达。还发现一些以前未知的与炎症 相关基因的表达，如人基质金属弹性蛋白酶 (humanmatrixmetallo-elastase)和黑素瘤生长刺激因子 (melanomagrowthstimulatoryfactor)。同时，与一个来 自 外周血基因文库的1046个cDNA克隆的阵列作这两种病变状 态基因差异表达的比较，发现在类风湿关节炎组织中金属蛋 白酶组织抑制物1,铁蛋白轻链和镒超氧化物歧化酶表达明 显升高5。通过该研究，确定了许多基因与这两种病变的 关系，为治疗和发病机
16、制的研究提供了新的思路。2. 3基因突变的检测肿瘤和遗传疾病发生的根本原因 是由于遗传物质发生了改变。检测基因突变对于阐明肿瘤及 遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。DNA芯 片技术是一项高效、准确的DNA序列分析技术，将DAN芯片 用于检测分子突变，不仅可准确地确定突变位点和突变类 型，更主要的是它的快速高效是目前所用的其他方法无法比 拟的，它可以同时检测多个基因乃至整个基因组的突变。如 Chee等6用含有1. 35×； 105个长度为25nt的寡核昔 酸探针，分析了 16.6kb的人类线粒体基因组DNA(mtDNA), 共分析了 10个样本，检测出了 505个多态性位点，并在 Leber&prime； s遗传性视神经疾病患者的mtDNA中检测出3 个致病性突变位点o Hacia等7在1. 28cm×； 1. 28cm的 芯片上固定了 9. 66×；104个长度为20nt的寡核昔酸探 针，用于检测乳腺癌基因BRCA1的exonll(3. 45kb)中所有
