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1、临床医学论文126例急性白血病异常免疫表型分析作者：贺景娟，李耀华，孙雪静,万岁桂，徐娟，苏力，出丁【摘要白血病细胞异常免疫表型是区别于正常造血细胞的重要特征之，也是流式细胞术检测微小残留病的基础。为了了解急性白血病的异常免疫表型特 征，本硏究采用四色流式细胞术CD45/SSC双参数散点图设门技术对126例急性 白血病患者的斤常免疫表型进行分析，并初步探讨其在微小残留病检测中的意 义。结果显示：约76%的患者可以检测到明确的异常抗原表达，白血病异常免疫表型可分为以下四类：抗原跨系列表达、跨阶段表达、过度表达及缺失表达， 其阳性率分别为39%、46%、21%和29%。约11 %的患者仅发生了单一
2、的表型异常，其余患者则可以检测到两类或更多的表型异常。结论：在大多数急性白血 病患者中可以检测到明确的白血病斤常免疫表型，在此基础上应用多参数流式细 胞仪可以冇效检测微小残留病变。【关键词】急性白血病Aberrant Immunophenotypes in 126 Patients with Acute LeukemiaAbstract The existence of leukemia aberrant immunophenotypes (LATP) has been suggested to be a valuable tool for the detect ion of minimal
3、residual disease (MRD), as they could di st ingui sh leukemic cel Is from normal hematopoietic progeni tors. This study was purposed to analyze the characterist ics of LATP in acute leukemia and further explore the proportion of different types of LAIP in acute leukemia patients Flow cytomet ry (FCM
4、) wi th four color and CD45/SSC gat ing were used to detect the antigen expression in samples of bone marrow from 126 patients wi th acute leukemia The results showed that definite LAIP could be detected in about 76% pat ients. The LAIP could be divided into four groups as cross lineage antigen expr
5、ession, asynchronous antigen expression, antigen overexpression and ant igen lack expression. The percentages of these LAIPs were 39%, 46%, 21% and 29% respectively. About 11%out of analyzed cases showed the cxistance of only one aberrant phenotype whi1c two or more of aberrant phenotypes could be d
6、etected in majori ty cases. 11 i s concluded that the LAIP with four subgroups can be detected in the majori ty of patients wi th acute leukemia and immunophenotyping based on LAIP is applicable for the detection of MRD.Key words acute leukemia; leukemia aberrant immunophenotype; minimal residual di
7、sease急性白血病是一种克隆性恶性增殖的血液系统疾病，恶性细胞抗原的表达具 有很大的异质性。异常表达的抗原不仅在初发的白血病细胞中可以检测到，而口 在治疗后达到形态学完全缓解(CR)时，残存的白血病细胞仍j保留其初发时的抗 原异常表达1。白血病细胞的克隆性增殖特征为临床白血病免疫分型诊断及 微小残留病（MRD）检测提供了更准确依据。白血病细胞上界常表达的抗原称为白血病界常免疫表型(leukemiaaberrant immunophenotyping, LATP) ,LAIP是白血病细胞与正常造血细胞相区 别的重要特征之一，也是流式细胞术(flow cytometry, FCM)免疫分型诊断及
8、 MRD检测的基础。综合文献报道26，LAIP主要包括以下4种类型：抗原跨 系列表达、跨阶段表达、过度表达及缺失表达。本硏究采用四色流式细胞术及 CD45/SSC双参数散点图设门的方法对126例急性白血病患者进行了全面的异常 免疫表型分析，以期对急性白血病的临床诊断及MRD的检测提供帮助。材料和方法病例资料126例急性白血病患者来源于宣武医院血液科1999年11月-2006年06月期 间的门诊或住院病人，其中男性71例，女性55例，中位年龄46 ( 14-89)岁。 所冇患者都经骨髓形态学、细胞化学及流式细胞术免疫分型诊断。FCM分型中髓 系、淋系列抗原确定标准参照EGIL评分7，形态学诊断及
9、分型标准参见白 血病的诊断及疗效标准8。FAB亚型诊断结果:Ml /M2 78例，M4/M5 17例, M6/M7 5例，B ALL 17例以及T ALL 9例。由于多数急性早幼粒细胞白血病(APL，AML M3)异常免疫表型不明显9，因此未将M3纳入硏究范围。实验材料单克隆抗体 初发急性白血病患者FCM免疫分型检测所需抗体基本资料见表1。流式细胞仪 FACSCalibur型(Becton Dickinson公司产品)，功率为15MW，激光光源采用氮离子气休激光器，波长为488 nm、进行PE、FTTC、PerCP等荧光素的检测另配有小功率半导体激光器波长为635 nm，进行APC的检测。结合
10、两个物理参数，前向散射光(forward scatter，FSC)及侧向散射光(side scatter, SSC)，可进行4色6参数的综合分析。实验方法标本处理、单克隆抗体标记 骨髓液直接免疫荧光标记法。采集初发急性白 血病患者的骨髓液35 ml，肝素抗凝，用PBS pH値7.2-7.4稀释后调节细胞 浓度至(25)xl07/ml，室温下进行单克隆抗体标记，详见荧光抗体标记说明书。 每次检测各种荧光素均设定相应抗体的同型阴性对照。初发患者免疫分型抗体组合免疫分型抗体组合见表2。实验各管均加入CD45 PerCP以进行CD45/SSC双参数散点图设门。上机检测每次细胞获取前先用FACScomp
11、自动软件分析标准荧光微球(cal ibrat ion beads)以校准仪器样本收集及结果分析均采用Cel 1 Quest(version3.2)软件进行。由于白血病样本通常存在异常的散射光特征及较强的 自发荧光，部分患者样本在数据获取前须进行条件设置优化：作FSC/SSC二维散 点图，调节FSC增益及SSC检测电压，使不同细胞群既能全部显示在散点图内， 又可清楚区分，同时调节FSC阈値去除大部分碎片。初诊患者每管收集10 000 个细胞。所有检测均采用CD45/SSC双参数散点图框定白血病细胞的位置(设门)， 再对门内细胞进行各种荧光抗体的分析。设门内细胞人于相应阴性对照20%确 定为抗原阳
12、性表达。统计学分析采用Epidata 7.0软件两次输入数据并校准，应用STATA7.0软件包迸行统 计学分析，本硏究中数据假设检验均采用双侧检验，以p0.05作为显著性检验 的标准。结 果126例初发非M3患者免疫表型分析显示，96例(76%)存在明确LATP，其 中14例(11%)患者仅见单一的LAIP类型，其余患者均可见两类或更多的表型 异常。各类异常表型的分布与FAB亚型无明显相关。抗原跨系列表达49例(39%)患者存在明确的抗原跨系列表达，在伴淋系抗原表达的AML (Ly+ AML)病例中，CD7+ 24例、CD19+ 11例。伴髓系抗原表达的ALL (My+ALL)病例中，CD13
13、+、CD33+和CD117+的例数分别为6、4和2例。在图1上 一行的AML M2患者的流式细胞图中可见髓系幼稚细胞群表迖CD33同时又跨系 列表达CD7，而下一行的正常对照者图中无CD33/CD7共表达细胞群(图I)。Figure 1. Cross 1incagc antigen expression (CD7+ AML M2).抗原跨阶段表达58例(46%)患者可见抗原跨阶段表达，在AML病例以CD34+CDllb+共表达 和CD34+CD56+共表达两种异常最多见，跨阶段异常在ALL较少见，仅2例见CD34+CD20+共阳性的异常表型。在图2上一行为AML Ml患者的流式细胞图中 可见幼
14、稚髓系细胞群同时表达CD34和CDllb，而下一行为健康对照者图中，无 异常表达的细胞群（图2）。Figure 2. Asynchronous antigen expression （AMLMl） 抗原过度表达异常27例（21 % ）患者可见抗原过度表迖异常，在AML病例以CD34、CD11 b、CD56 及CD117的过度表达为主。CD10和CD7分别是B ALL和T ALL中最常见的 过度表达抗原。在图3上一行T ALL患者的流式细胞图中可见幼稚淋系细胞群 过度表达CD7，而下一行健康对照者图中则无（图3）。Figure 3. Antigen over expression （T ALL）
15、.抗原的缺失表达异常37例（29%） AML患者可以检测到抗原的缺失表达异常，以CD13、CD33及 HLA DR等抗原易见。9例（52.9%） B ALL患者可见的CD45表达缺失或明 显减弱，1例T ALL患者呈CD2表达缺失。图4的上一行为AML M2患者流 式细胞图中幼稚髓系细胞群HLADR表达缺失，而健康对照者图中可见HLADR表达（图4） 讨 论Food等10于1986年首次在Blood杂志上报道了利用FCM免疫分型方法诊断白血病与淋巴瘤。1997年，Borowi tz等11首次拟定了利用FCM 免疫分 型法诊断白血病的诊断标准。近年来，FCM已由当吋代表科技潮流的高精仪器变 为现
16、在血液系统恶性疾患诊治中不可缺少的检测工具。本组126例初发非M3急性白血病患者免疫分型结果显示，约76%的患者初 发时存在异常免疫表型，AML与ALL分别为69%和88%。AML异常表型的阳性率 略高于Macedo等12的报道，可能与对某些异常表型确定标准的差异有关， 例如Macedo等未将CD117+CD15+的抗原组合列入异常表型范围，但我们的经验 是，正常骨髓中CD117+CD15+双阳性细胞的比例0.01%，可以作为一种异常的免 疫表型与正常造血细胞相区别。早期报道关于AML LAIP的数据明显较低，可 能与对异常免疫表型的认识不足及标记的荧光抗体较少有关。关于各类LATP的报道存在很大差异。跨系列表达异常的发生率总体在5% -60%，本硏究中，Ly+AML的阳性率在34%左右，而My
