实验三消毒灭菌和药敏试验实验内容和要求 1.掌握药敏试验的原理、步骤、结果及 意义 2.掌握常用的消毒与灭菌技术 3.熟悉紫外线杀菌试验的原理 4.了解细菌L型的诱导和菌落类型一、药敏试验在感染性疾病防治中的意义 近年来，由于各种抗菌药物的广泛应用，导致耐药菌株的迅速增多尤其是广谱及超广谱抗生素的普遍使用，造成耐药菌株大量出现，给临床治疗带来极大的困难同时，由于不合理的使用抗生素，治疗的失败率及不良反应均有增加因此，药敏试验在感染性疾病的防治方面具有日益重要的实际意义 二.培养+药敏的目的 1、 确定导致感染的病原菌的种类，对于不同的病原菌（G-杆菌或G+球菌，条件致病菌或急性传染病病原菌）需要采取不同的治疗措施2、 确定病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床根据病人情况合理用药由于细菌耐药性的快速增长，单纯依赖经验选用药物经常无效，在更多的时候需要参考药敏实验的结果 3、用于流行病学调查及院内感染的监控，减少耐药菌株的流行 三、什么情况下需要做培养+药敏？ 感染原因无法确定 病原菌的耐药性无法确定，经验用药可能失败（尤其是免疫力低下患者、长期使用抗生素者、ICU病房、院内感染患者、接受导管插入或其他创伤性治疗患者。
病人对可用药物过敏，需要检测其他药物的耐药性 病人个体情况要求对某些药物精确用药，需要测定其最低抑菌浓度（MIC）四、常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测方法介绍 其原理： 体外测定抗生素药物抑菌或杀菌的能力可帮助临床对感染性疾病选择最佳用药，还可进行流行病学调查，了解某些致病菌耐药性变异情况 纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 联合药物敏感试验 特殊耐药菌及耐药酶的表型检测 耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测 -内酰胺酶、超广谱-内酰胺酶检测等五、纸片扩散法（K-B法） 原理： 含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑制浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小 方法： 菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准； 涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60，最后沿平板内缘涂抹1周； 贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm； 孵育：35C 16-18h，量取抑菌圈直径。
注意事项1 纸片应分布均匀，中心距离不小于24mm2 含菌平板必须避免过浓或过稀3 纸片贴完后应在15min内将平板反过来，置于37度温箱中4 纸片一旦接触培养基就不应再挪动位置5 要注意无菌操作影响药敏结果的因素培养基应根据试验菌的营养需要进行配制倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性细菌接种量细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性药物浓度药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制商品药应严格按照其推荐治疗量配制培养时间一般培养温度和时间为37，8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4冰箱内24小时，使抗菌药预扩散，然后再放37温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈 结果判读： 用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）标准判读结果； 报告：细菌对该抗生素是 敏感（susceptible，S）； 耐药（resistant，R）； 还是中介（intermediate，I）。
六、如何理解MIC值及药敏结果？ 每种药物均提供定性和定量两种结果定性：敏感（S）表示该药物对该细菌有抑制或杀灭作用使用常规剂量可以达到有效的治疗效果中介（中度敏感，I）表示细菌对该药物治疗的敏感性低于敏感菌株，必须加大剂量以达到更高的血药浓度才能在特定的生理部位获得有效的临床效力；对于使用剂量有严格限制的药物则必须重复测试以确定敏感还是耐药耐药（R）表示药物常规剂量所达到的药物浓度不能抑制或杀死细菌，即使加大剂量也不能达到治疗效果或者超过了人体的正常耐受水平定量：MIC（最低抑菌浓度）表示在体外达到抑制细菌生长所需要的最低的药物浓度临床治疗要求的血药浓度一般为MIC值（g/ml） 的4-8倍对于不同部位的不同药物，其浓度可能更高或更低应具体情况具体分析，不可一概而论 长期使用抗生素的病人应该怎样做药敏试验？ 长期使用抗生素的病人尤其是住院病人应该经常做药敏试验所谓的长期，并不是一个很长的时间概念，住院病人每隔3-4天就需要做一次细菌学检查对于ICU病房的病人，可能每天都要做细菌学检查因为这些病人多数免疫力较差，容易受条件致病菌的侵犯，而且反复发作此外病原菌常呈多重耐药性，产超广谱-内酰胺酶的G-杆菌（ESBL）以及耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA和MRSCN）、产AmpC酶的阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌在ICU病房最为常见。
对于长期使用抗生素的病人，其感染有以下几个特点； 1.长期使用抗生素的病人，不同时期（即使在很短的时间内）感染的病原菌种类可能不同，耐药性因此也不相同 2、同一株细菌，在长时间用药时，仅需要3-4天就可以从对某种药物敏感发展为耐药 3.长期使用抗生素容易诱发细菌产生L型变异常规培养阴性时，进行L型细菌培养能够提高检出率形成条件：生物学特性：与医学关系：细胞壁中肽聚糖结构受理化或生物因素的直接破坏或合成抑制而形成形态多形性 ；染色革兰阴性；培养高渗培养基；菌落油煎蛋样 仍有一定致病性细菌L型细胞壁缺陷细菌临床分离葡萄球菌L型葡萄球菌L型回复后 灭菌杀灭或除去所有微生物的繁殖体和芽胞 消毒杀灭或除去病原微生物 防腐抑制微生物的生长与繁殖抑菌剂或防腐剂 除菌:用冲洗、过滤等机械手段除去微生物的方法 化疗：用对病原菌有毒力但对机体无害的化学物质杀灭或抑制机体内病原微生物的方法消毒与灭菌技术基本概念擦拭法高压蒸汽灭菌法常用消毒灭菌的方法物理法 化学法浸泡法熏蒸法喷雾法热力消毒法生物净化法辐射消毒法燃烧法烤箱法煮沸法干热法湿热法日光曝晒法紫外线灯照射法电子灭菌灯法电离辐射法煮沸消毒法 操作规程将物品刷洗干净，全部浸没在水中，或在水中加入碳酸氢钠配成1一2的浓度，可将沸点提高到105还可去污防锈。
加热煮沸水沸后开始计时510 min，如中途加入物品，则在第二次水沸后重新计时关闭热源，用无菌持物钳取出消毒物品 焚烧-最彻底的灭菌方法烧灼-直接用火焰灭菌方法 如接种环、试管口、三角瓶口干烤-加热160-170 2h 玻璃器皿、陶瓷1、干热灭菌法红外线-热效应，与干烤类似灭菌效果：可杀死营养体和芽胞2.湿热灭菌法高压蒸汽灭菌法（热压灭菌法）最有效的湿热灭菌法 121 15-20mim（杀芽胞)煮沸消毒法水煮100 5mim(杀繁殖体)-2h(杀芽胞)流通蒸汽消毒法巴氏消毒法间歇蒸汽灭菌法水蒸汽100 15-30mim(杀繁殖体)反复多次流动蒸汽间歇加热灭菌(杀芽胞）较低的温度 61 30mim/71 30s（杀致病菌）效果比干热好压力蒸汽灭菌的效果监测物理监测法用150或200的留点温度计使用前将温度计汞柱甩至50以下，放入包裹内，灭菌后检查其读数是否达到灭菌温度化学监测法主要是通过化学指示剂的化学反应，灭菌后呈现的颜色变化来辨别是否达到灭菌的要求临床常用的化学指示卡与化学指示胶带，化学指示卡放在包的中央，化学指示胶带粘贴在包的外面 生物监测法是最可靠的监测法，利用对热耐受力较强的非致病性嗜热脂肪杆菌芽孢作为指示剂，制成每片含106个嗜热脂肪杆菌芽孢的菌纸片,使用时将10片菌纸片分别放于灭菌器四角及中央，待灭菌完毕，用无菌镊取出后再放人培养基内，在56温箱中培养48h至1周，若全部菌纸片无细菌生长则表示灭菌合格。
消毒与灭菌技术 辐射灭菌法 非电离辐射：紫外线 最佳杀菌波长为250270nm 杀菌机理：干扰DNA的复制与转录 特点：紫外线穿透力较弱 适应范围：紫外线消毒适用于 空气消毒与物品表面的消毒消毒与灭菌技术滤过除菌法 杀菌机理：含有微细小孔0.22m,只允许液体或气体及孔径0.22m的颗粒通过，细菌不能滤过 不能除病毒、支原体 适用范围：血清、毒素、输液、生物制品、抗生素以及空气等的除菌 促进菌体蛋白质变性凝固（酚、醇、醛、酸碱类等） 干扰细菌酶系统和代谢（氧化剂、重金属盐类等） 损伤细菌细胞膜，增加其通透性（表面活性剂、脂溶剂等） 菌体成分氧化、水解或结构改变（氧化剂、卤素、醛、酚等）消毒与灭菌技术 化学消毒剂作用机制消毒剂类别名称浓度(%)用途重金属盐红汞2皮肤、粘膜、小创面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化剂高锰酸钾0.1皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒过氧化氢3皮肤、粘膜、创伤消毒过氧乙酸0.20.5塑料、玻璃、人造纤维消毒卤素类碘液2.5皮肤消毒醇类乙醇7075皮肤、体温计消毒酚类石炭酸35地面、器皿表面和排泄物消毒来苏35同上、也常用于手及皮肤消毒表面活性剂新洁尔灭0.1手术器械消毒酸碱类生石灰1:41:8排泄物、地面消毒染料龙胆紫24表浅创伤消毒化学消毒剂的使用方法浸泡法 侵泡法是将物品洗净、擦干后，浸没在消毒液中进行消毒灭菌的方法。
擦拭法 擦拭法是用消毒剂直接擦拭人体或物品表面，如皮肤、桌椅等，达到消毒灭菌的方法喷雾法 喷雾法是利用喷雾器将消毒剂变成微粒气雾弥散在空气中对空气和物品表面进行消毒灭菌的方法熏蒸法 熏蒸法是将消毒剂加热或加人氧化剂，使其产生气体来进行消毒灭菌的方法化学消毒剂的使用方法 问题与讨论1.常见的消毒灭菌技术有哪些？分别有什么用途？灭菌的标准是什么？2.紫外线杀菌作用的原理如何？有什么特点？3.什么是细菌L型？细菌L型的形态染色有什么特点？分离培养细菌L型的培养基有什么特点？本次实验课结束明天看试验结果，值日同学留下实验四 化脓性球菌和肠道杆菌的病原学检测（1）再见！。