第二章第二章 柱色谱法和纸色谱法柱色谱法和纸色谱法 l第一节 柱上色谱法l柱上色谱可分为: 柱上吸附色谱法、l 柱上离子交换色谱法、l 柱上分配色谱法、l 柱上凝胶色谱法柱上色谱法是比较古老的1903年，Tswett提出来由于此法别离效率低，速度慢，因之在五十年代以前为主要的别离技术，但五十年代后，由于其它色谱技术薄层色谱、气相色谱的出现，其应用受到很大限制但是由于此种方法所用设备和操作方法都比较简单，可处理大量样品，在有机分析中，主要可用于有机样品的提纯脱脂、脱色、脱胶、脱水，初步别离或制备纯样品等，因之该法仍然为人们所采用此外，随着天然产物化学的开展，许多天然有机物的应用价值日益进步，而这些化合物往往又难于合成，因之从天然界提取就成了唯一来源，这就必须采用制备型柱色谱技术故柱色谱也是植物化学工作的主要技术之一l1柱上吸附色谱法l原理：l按照各组分在吸附剂上的吸附才能大小来别离的l吸附剂的选择凭经历决定 ：l一种适宜的吸附剂应该具备这样一些条件：l1它可以可逆地吸附待层析的物质；l2它不会引起被吸附物质的化学变化；l3它的粒度大小应该能使显层剂以适宜的速率流过；l4吸附剂最好是白色的或浅色的，以便于对色层带进展观察；l5颗粒具有一定的机械强度，操作时不易破碎；l6不能与待别离物质及流动相产生化学反响，也不应互相溶解。
l一般弱极性溶质宜选用强极性吸附剂，而强极性溶质宜用弱极性吸附剂l最常用的吸附剂：氧化铝和硅胶它们能符合上述要求，并且经过不同处理可以随意得到不同的活度例如，氧化铝可以在不同温度烘干到达各种不同的活度l必须指出，活性大的吸附剂用于色谱法并不一定最适宜，因为活性太大，物质被吸附得太牢，以致不易被洗脱下来l其他较常用的吸附剂有：l氧化镁用于吸附烃、醇、酮、醚及硝基物等，碳酸钙用于吸附叶绿素l硫酸钙用于吸附花色苷、维生素K1，氧化钙、氧化钛、碳酸钡、硫酸镁、无水碳酸钠应用于吸附叶绿素，滑石粉用于吸附有机酸、酚类、2,4-二硝基苯腙，硅藻土、蔗糖用于吸附叶绿素及淀粉等l许多吸附剂遇水即失去活性，这时只能用无水溶剂 l实验技术l吸附剂的粒度及用量：一般在80300目间变动粒度细，别离效果好，但速度太慢吸附剂的用量，一般为样品的3050倍，有时达100倍l色谱柱：很简单，只需要一支适当长度、适当口径的玻璃管，管下口做一紧缩处及一斜口，再连一个吸滤瓶即可柱长与内径之比在10 1 4 1间较好l装柱方法有两种：干法装柱，将吸附剂由柱口装入，边装边轻敲打，以使吸附剂装填密实均匀吸附剂装完后，把淋洗剂沿管壁轻轻参加，使之浸润吸附剂，淋洗剂参加后发现柱内有气泡时，可敲打柱体或施加适当压力以压缩气泡，使气泡随淋洗剂一起排出。
湿法装柱，有两种操作方法：方法：先将柱体下端活塞拧死，向柱内参加一定高度之淋洗剂，然后将吸附剂自上端渐渐参加，淋洗剂的液面一定要高出吸附剂层吸附剂加完后，翻开活塞，放出淋洗剂，直至吸附剂层不在沉降为止方法：将吸附剂用淋洗剂调成糊状，渐渐倒入柱中，在保证淋洗剂液面略高于吸附层条件下，让淋洗剂自柱中渐渐流出，直至吸附剂沉降不在变动为止不管何种方法装柱，要求装好之柱体密实均匀，无气泡，在淋洗过程中无裂纹出现，一般湿法装柱比干法好l被别离样品的准备：柱色谱所用样品溶液一般配成较浓的溶液，最好为饱和液，这样样品加到柱顶集中，别离效果好，配制样品所用的溶剂极性要小，以利于样品立即被吸附剂吸附假设样品在低级性的溶剂中溶解度很低，最好将样品用一适宜的溶剂溶解，再与吸附剂相拌，低温烘干待上样l上样：样品溶液配好后可开始加样，方法为当柱内淋洗剂流至液面与吸附剂面相平时，将样品溶液沿管壁参加柱内，注意不要让样品溶液自由落下而打乱柱顶吸附剂层当样品液面和吸附剂面相平时，用样品溶剂数滴沿管壁参加，以洗净管壁上的样品液，当液面与吸附剂面再次相平时，参加显层剂进展显层假设是和吸附剂相拌的样品，将柱内淋洗剂不要流至与吸附剂面相平，要保持一定的淋洗剂高度，将样品粉末缓缓地参加，并轻轻敲击柱子使气泡充分地排除，加完样品后，让淋洗剂流至与吸附剂外表相平，用样品溶剂数滴沿管壁参加，以洗净管壁上的样品液，当液面与吸附剂面再次相平时，参加显层剂进展显层。
显层: 使样品各组分在柱内进展别离的过程叫显层，此过程中所用的溶剂叫显层剂显层剂的选择 :一般来说，显层剂的极性比样品极性小些常用的显层剂有石油醚，二硫化碳，苯，四氯化碳，氯仿代表弱极性显层剂，乙醚，异丙醚中等显层剂，低分子量的醇、酮强显层剂等，一般可用单一种，也可用混合剂，一般先试之，最后确定出适宜之显层剂来显层方法：待柱上样品液面与吸附剂面相平后，参加显层剂，并始终保持显层剂面高出吸附剂面，待第一个组分估计由柱下端开始流出时，停顿加显色剂，显层完毕注意： 有机物自吸附剂上被洗提出来的先后次序一般是：饱和烃，烯烃，双烯烃，芳烃，醚，酯，酮，醇，二元醇及羧酸l色层的别离方法：l1推出法：将吸附剂自吸附管中推出，用小刀将各色层带切开，分别用适当溶剂提取，滤去吸附剂，将滤液浓缩就可以得到各组分当用这种方法别离时，吸附柱玻璃管不能用下口紧缩的，而必须是两头都开的l2洗提法：待显层后，用一种极性较强、吸附力较大的溶剂将各组分依次顶替下来，用几个接收器分别接收流出的各个组分这一步骤常称为“洗提洗提用的溶剂称为洗提剂将各分洗提液分别浓缩即得到各组分l无色物质层析时找出色层带的方法：l将吸附柱系统地切断，将各段逐一用溶液洗提，鉴定各洗提液中的物质。
l连续地洗提吸附柱，分别用接收器接收一定量的洗提液，然后鉴定各洗提液中的物质l层析完毕后，用显色剂显色常用的显色剂下表l用紫外光照射，使能发荧光的物质发生荧光对于不发荧光的无色物质，可以用发荧光的吸附剂就是在普通吸附剂中参加某种能在在紫外光照射下发荧光的无机物如硫酸锌或有机染料该荧光染料不致降低吸附剂的活性，且在给定的吸附条件下又不会被洗提出来为宜这时在柱上形成的色层带相应地改变了吸附剂原来的荧光的强度，借这种改变可以理解色层带的位置常用的荧光染料如桑色素morin用于三氧化铝柱，小檗碱berberine用于硅胶柱，二苯基荧光吲啶磺酸diphenylfluorin-dine sulfone sulfonic acid及桑色素用于氧化镁或氢氧化钙柱l制备有色衍生物，然后进展色谱分析 l柱上层析常用的各种显色剂* l化合物 显色剂 l烯 烃 先用3mg藏红溶于25 mL水的溶液处理，然后用0.1mol/LKI溶液加有45滴处理，藏l 红的原来颜色被漂白，但当含有不饱和烃、砜、二芳基胺或三芳基胺存在时，色层带上l 红色重新出现 l醇类 四个碳原子以上的醇可先用每升含200至300mg钒酸铵溶液处理，再用8-羟基喹啉溶于l 6%的乙酸所成的2.5%的溶液处理。
色层带在暗绿色背景上显橙棕色l酚类 1香草醛溶于浓硫酸所成1%的溶液，色层带显淡红至红色l 2重氮盐溶液，色层带显黄至红色l醛与酮类 用2,4-二硝基苯肼饱和的2mol/L溶液，色层带显黄色，醛用希夫试剂处理，显紫红色l 胺 1四氯对醌在1,4-二氧六环中的饱和溶液是对脂肪胺的最好显色剂，在橙色背景上色层l 带显绿色l 21%氟硼酸对硝基亚氮盐水溶液是检出芳胺色层带的很有效显色剂色层带呈橙至红 l 色，酚类也有同样反响l 表示有硫醇存在，这时如再用硫在苯中的饱和溶液处理，色层带即转变为灰色至黑色l 硫醚 以0.5gKI溶于25mL水中，再参加两滴2M氯化金溶液，作显色剂，硫醚色层带在粉红色背景l 上显棕至黑色，胺有同样反响，但胺的吸附力强，留在柱的上端，因此得与硫醚区别l 芳环 将10mL浓硫酸与0.2mL37%的甲醛溶液混合作显色剂，单环芳烃显红的色带一般说来，双环或多环芳 l 烃显绿色或蓝绿色色层带，此种溶液必须当天配制l *本表所列各显色剂是在以苯作为显层剂，以硅胶作为吸附剂的情况下使用的，本表中各试剂的百分l浓度，均指重量百分比l2柱上离子交换色谱法 l1离子交换树脂 l柱上离子交换色谱主要用来除去样品中微量电介质杂质。
其装置与柱上吸附色谱一样固定相为离子交换树脂l离子交换树脂的种类很多，但可分为两大类型：阴离子交换树脂和阳离子交换树脂均为高分子化合物 阳离子交换树脂一般为Na型高分子钠盐使用前要用稀盐酸浸泡处理为H型，然后进展交换，以磺化交联聚苯乙烯为例，再生和交换原理如下表示：此外还有交联丙烯酸盐或磷酸盐等阳离子交换树脂 阴离子交换树脂一般为高分子的氯化季铵盐化合物，称Cl型，使用前要用稀碱处理为OH型，然后交换，以交联聚苯乙烯氯化季铵盐为例，其再生和交换如下： 此外，其它类型阴离子交换树脂还有交联丙烯酸仲铵型、叔铵型或季铵型 2 装柱：取一支400mm10mm滴定管，下端放少许玻璃棉，关闭活塞，将处理好的树脂倒入至150200mm高度即可 由于每种树脂都有一定的交换才能，一般每毫克干树脂约可交换19mmol离子，但一般操作中，只需交换二分之一最大量即可据此就可算出树脂的用量及柱体的大小3交换：将待测样品液由装好的柱上部倒入，由柱下部放出，或由下部参加而由上部排出但流速应以待处理溶液在柱内有一定停留时间为准4洗提：样品液处理完后，用另一种电解质通入柱内，将已交换于柱上的离子用新的离子顶替出来，从而到达别离或提取目的。
5再生：再生是树脂恢复为H型或OH型的操作，此步可与洗提为同步，也可不同步，不同步时，即用酸或碱浸泡树脂即可l6举例：lA 糖中除酸葡萄糖中除去柠檬酸l向阴离子交换柱中通入糖液，那么柠檬酸负离子被交换于树脂上，排出糖液，那么到达别离目的树脂用碳酸铵液洗提，那么得柠檬酸铵溶液然后树脂再用NaOH液再生B 除去羰基化合物异丙醇中除去少量丙酮向阴离子交换柱中参加亚硫酸氢钠液，那么亚硫酸氢根负离子交换于树脂上，用水洗至无碱性，然后通入异丙醇丙酮样品，那么丙酮与交换于柱上之亚硫酸氢根负离子加成而留于树脂上，而余下之异丙醇那么流出，从而到达别离目的然后向柱中再通入稀NaCl液，那么氯离子顶替出亚硫酸氢钠和丙酮，完成洗涤任务，最后树脂再于碱液中再生离子交换色谱交换物质量很小，只适于半微量样品中微量杂质的除去另外一般要求样品为水溶液时才好交换，而且交换下来的洗提液都很稀，组分回收困难，故对于样品已处于很稀溶液时而且再无更好别离方法时才用此法除了上述吸附柱色谱和离子交换柱色谱外，还有凝胶柱色谱和分配柱色谱 纸上色谱法是分配色谱法中较常用的最简单操作之一是取一条滤纸，悬挂在一个支架上，使它的底端浸入一盛有溶剂的浅皿中。
在纸下端刚好高出液面部分用毛细管滴上一滴试液将支架置于密闭容器内，使纸周围为溶剂蒸汽所饱和，静置数小时，在这期间，溶剂由于纸上毛细管作用而沿滤纸上升当溶剂前沿升到快近纸条上端时，取下滤纸使之枯燥假设试液中的化合物是有颜色的，那么纸上会显出各组分斑点较常见的情况是，层析的化合物是无色的，那么，待纸枯燥后，于纸上喷以显色剂而使化合物斑点显色上法为上行纸上色谱法第二节 纸上色谱法同理也有下行纸上色谱法上行法一般需时间较多，但溶质在两相中的分配较易到达平衡所以产生的斑点面积紧凑园整组分易于分开下行法快，省时间，对易别离化合物最好采用下行法此外也可采用双向纸上色谱法纸上色谱法的Rf值，通常要受到以下因素的影响：1纸的质量；2温度；3化合物取量；4溶剂；5试样原点与溶剂液面之间的间隔 l利用纸上色谱法的Rf值作为鉴定有机化合物的凭据时，最好用标准样品在一样实验条件下，平行对照层析假设两者Rf值一样，方可断定是同一物质l为了使纸上色谱法得到正确结果，必须注意以下事项：l不要用手指直接接触层析部分的滤纸，以防手上油渍染污滤纸l滤纸必须剪平整l滤纸周围必须被溶剂蒸气所饱和否那么就有可能当显层剂到达纸上某一处时，它的蒸发速度大于毛细管吸引速度，致使已经分开的各组分重新在这里聚集。
随溶剂蒸气压的大小不同和层析缸的。