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1、海南霉素补料工艺的探讨3100字摘要：通过对海南霉素发酵代谢在线实时曲线,以及发酵过程中总糖、还原糖、氨基氮、pIR菌 浓、菌丝形态、发酵单位等理化指标的分析研究，发现通过补料来补充碳源和氮源可以弥补 发酵后期因碳氮比例失调而导致菌丝体断裂、白溶、从而导致产物合成能力衰退。补料可以 延长到达发酵终点门）的时间，达到增产增效的日的。关键词:海南霉素、碳源、氮源、补料工艺海南霉索是一种新型的聚醸类抗生索，是从稠李链霉菌（,8）东方变种培养物中提取获 得的白主开发的抗生素兽药，它是一种新型的消化促进剂，主要用来防治鸡球虫病（2） 和家畜的饲料添加剂，是迄今为止我国唯一批准上市的属一类新药的抗球虫药（
2、3）具有活 性高、无残留、无抗性等特点，其抗菌活性分别为盐霉素、莫能菌素的10倍和20倍。木实 验通过增加补料工艺来控制碳氮比例平衡以达到提高海南霉素发酵单位的目的。1材料与方法：1. 1实验中所用FCD- F2- 0801008菌种为实验室自技术转让方提供的砂土管保存菌种自 然分纯、传代得到的F2代斜血，摇瓶发酵单位3500ug/ mLo1.2分别采用50L和250L种子罐作为一二级种子罐,种了罐配方为：玉米淀粉1.5%,葡萄糖：1.0%,黄豆饼粉：1.0%,硫酸镁：0. 05%,磷酸氢二钾0. 05%,氯 化钠：0.5%。1.2. 1种子罐工艺一级种子：28. 5C,通风比1:0.8,15
3、0转/分，周期25-27小时二级种子:28. 5C,通风比1:1,200转/分，周期18-20小时1.2.2发酵采用6. 0m3罐，按3. 5 m3计料,消后3. 0 m3,发酵罐配方为：?玉米淀粉：8. 0%,簡萄糖：1.0%,黄豆饼粉：1.0%,蛋白豚：0. 5%,硫酸镁:0.05%,磷 酸氢二钾0. 05%,氯化钠:0.5%,酵母粉：0.5%,淀粉酶:0.02%。1.2.3发酵工艺温度:28C ;罐压:0.05MPa ;通风比:1： 1；溶解氧:30- 60%;2、补料采用流加的方式，总补料量为发酵总体积的15%,补料时间通过不同时间的理化指 标及效价结果确定。2. 1. 1补料配方：玉
4、米淀粉:1.5%, a-淀粉酶：0.2%,黄豆饼粉：0.5%,泡敌:0.2%。2. 1.2原材料的灭菌采用200L罐，按30%比例先将玉米淀粉、黄豆饼粉、泡敌投入罐内，冋调pll至7. 5左右, 通蒸汽加热至50C时加入淀粉酶,升温至80C恒温糊化15 min,然后升温至120-12VC, 消毒30min,降温至28-30C.从非补料工艺的理化指标分析来看，024小时为菌体生长阶段，其代谢变化为碳源 和氮源等进行分解代谢，菌体进行合成代谢，从而使新菌体不断被合成，菌浓明显增加，菌 体生长怛定示生长阶段结束，24小时之麻菌体由菌丝生长转为次级代谢，代谢产物为海南 霉索。海南霉索发酵过稈中，初级代
5、谢利用iT萄糖时问较长，造成前期菌体生长过盛；而转 入次级代谢后，碳氮比例偏小，导致碳源物质不足，因碳氮比例逐步减小，引起菌体过早衰 老，发酵单位增幅缓慢，后劲不足，最终放罐效价偏低。当总糖和还原糖比值约为1时， 基本达到发酵终点，出现氮基氮冋升，pH反弹，镜检发现菌丝有自溶现彖（5）,视野里散 落菌丝增多，终点总糖和还原糖明显低于工艺要求，煤响产索4)能力，周期延 长20小时生化检测效价降低(7)。4、补料实验方案：分别将补料开始时间设定为48hr. 60hr,补料截止时间均为90hr, 跟踪备个实验的代谢过程。48hr开始补料的发酵不同时间点的参数变化时间(h) 0, 24, 48, 72
6、, 96, 120, 140,总糖(g/100ml ) 8.80, 7.35, 6.88, 4.53, 3.42, 3.00, 2.35氨基氮(mg/100ml) 25.6, 20.38, 18. 28, 19.96, 20. 35, 20. 90, 25. 78 菌浓() 9, 24, 30, 34, 34, 35, 35pH 7. 08, 7.02, 6. 89, 6. 83, 6.85, 7.16, 7. 60效价(ug/nd) -，-，790, 2800, 3550, 4388,480048hr开始补料的代谢特点：总糖和还原糖的量一直比较稳定，补料量基本与糖耗速度 相符，发酵过穆碳氮比
7、例适中，发酵终点特征明显，pH轻微反弹，氮氮略有冋升，镜检未 见大量散落菌丝，菌丝空胞增多，效价涨幅较好。60hr开始补料的发酵不同时间点的参数变化时间(h) 0, 24, 48, 60, 96, 120, 140总糖(g/100ml) 9. 00, 7.56, 6.60, 5.70, 4.20, 3.20, 2. 16氨基氮(mg/100ml) 26.10, 21. 18, 18.20, 19. 20, 18. 30, 24. 50, 28. 70 菌浓(%)10, 24, 30, 32, 34, 33, 35pH 7. 13, 6.80, 6.87, 6.80, 6. 70, 7.56,
8、7.90效价(ug/ml) -，-，850 , 1400, 3700, 4200, 44406 Ohr补料的代谢特征：前期菌浓生长缓慢，菌体生长期延长，补料示总糖偏高，碳氮比 例发生变化，终点特征明显，菌丝体出现轻微自溶现彖，示期效价涨幅放缓。综上实验分析：微生物所处的环境在发酵过程中不断的变化，其物理、化学和生物参 数都随时间而变化，是个动态的过稈。在产物合成阶段，菌体物质的物质合成仍未停止，菌 体重最有所增加但基本不繁殖。这个卩介段的代谢变化是利川碳源和氮源来合成产物，基质浓 度的变化很容易影响这个阶段的代谢，碳源和氮源的浓度必须控制在一个最佳的范国内，才 能促进产物不断的被合成。如果这些
9、营养物质过多，菌体就会进行生长代谢从而抑制产物合 成。如果较少，菌体就会过早衰老从而合成能力下降。所以如果补料开始时问过早发酵前期 总糖和还原糖较高，菌浓生长较为缓慢，生长期就会延长，补料速度大于菌丝体的糖耗速度, 总糖偏高，菌丝革兰氏染色较重，菌丝生长较为吐盛，延缓产物合成。通过图表可以看出 48小时开始补料使得发酵代谢发生了明显的变化,在菌体生长期完成示，补料使菌体酶体系 处于最利于产物合成的状态。虽然发酵周期延长了 20小时，由于补充了碳源和氮源，总糖 和还原糖并没有发生太大的变化，最终碳氮比例没有失调。镜检未见大量断裂菌丝及菌丝体 白溶现象，同时pH反弹及氨氮冋升也没有正常工艺明显。从
10、发酵产物(6)积累上来看， 非补料工艺和补料工艺1 2 0小时效价基木相当，但采用流加补料在极少增加原料及动力消 耗的情况下效价达到了稳步增长，效价20小时增长了 412ug/ml.提高了 9. 1%,可见采用补 料工艺均比正常工艺提高了放罐效价，达到了延长周期提高发酵水平的目的。参考文献：(1) 曲音波.微生物技术开发原理.北京化学工业出版社，2005(2) 张延荣，宋玉芹，宋春阳，等.海南霉素在饲料中的毒性研究.莱阳农学院学报， 2004,21:18-19（3）陈志萍，刘学武，等。复方海南霉索的药效实验。兽医寄生虫病，2002, 10:49（4）黄幸纤，陈星若.环境化学物致突变、致癌实验方法。浙江科技出版社，1985（5）干.菊凝。当前对化学物的致癌性、诱变性筛选性短测的组合。国外医学.卫生学分册, 1990,1:16（6）沈萍。微生物学。高等教育出版社1999,4:207）崔明珍，肖白，卢庆生，等。抗坏酸肽体外致突变性的研究。1991,5:278（8）、陈佩君，武济民，吴艳，等.链霉菌W341的分类及其产物W341C的抗菌特性.全国第四次抗生素学术会议论文集（下）.上海:上海科学技术文献出版社，1982: 324
