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1、Bel 2、Bax、Fas、FasL、穿孔素和粒酶 B在移植肾急性排斥中的共同表达和意义作者：丁小明，薛武军，田普训，刘晓东【摘要】冃的 检测Bel 2、Bax. Fas、FasL.穿孔素和粒酶B 在移植肾急性排斥时的表达水平，探讨其在急性排斥中的作用及可能 的分子机制。方法选取30例移植肾穿刺活检标本及18例正常供肾组 织为研究对象，采用免疫组化方法检测Bel 2、Bax. Fas、FasL、 穿孔素和粒酶B的表达情况。结果 根据Banff97病理诊断标准， 急性排斥标本30例，其中I A 12例，I B 11例，IIA 5例，IIB 2 例；所有组织中均可发现细胞凋亡现象，急性排斥标本中史
2、为明显; Bel2在急性排斥标本中的表达水平低于正常组织(P<005),与急性排斥的病理变化呈负相关(P<0. 05) ； Bax在两组的表达水平 无差别(P>0. 05)； Fas、FasL穿孔素和粒酶B在急性排斥组中的 表达水平均高于对照组，并与急性排斥的病理变化呈正相关,以FasL 和粒酶B最为明显(P<0.01)o结论 Bel2在肾小管上皮细胞的表达减少提示急性排斥反应的发生；Bax对于预测急性排斥反应 的意义不大；Bel2、Fas、FasL、穿孔素和粒酶B的表达变化均与急性排斥反应密切相关，尤以FasL和粒酶B明显，可作为监测移植 肾形态学变化、功能状态以及判
3、断预后的重要指标。【关键词】细胞凋亡；肾脏移植；急性排斥反应ABSTRACT: Objective To detect intragraft expression of apoptotic molecules (Bel 2, Bax, Fas, FasL, Perforin and Granzyme B) during acute rejection of human renml allografts, and access the role in acute rejection. Methods Thirty tissue specimens were obtained from biops
4、y The specimens were classified on the basi s of the BanffcriteriaImmunohistochemistry was used for detecting the expression of apoptotic molecules in the renal grafts Results There were 30 acute rejection specimens: I A (n=l2), I B(n=l 1), IIA(n=5), and IIB (n=2) Apoptotic cells were found in all t
5、he samples, and more obvious during acute rejection. Tn the acute rejection specimens, the expression of Bel 2 decreased (P&It;0. 05) Bax was found in all the samples at a certain level, and there was no significance between the two groups (P>0 05). Fas, FasL, Perforin and Granzyme B were increas
6、ed during acute rejection, and there was a correlation of the expression of FasL and Granzyme B with histological changes (P<0.01). Conclusion The decrease of Bel 2 of the grafts indicates that it was invol ved in acute renal rejection. Bax could not reflect the onset of acute renal rejection. Fa
7、sL and Granzyme are useful for monitoring the histology and function of renalallografts.KEY WORDS: apoptosis; renal transplantation; acute rejection尽管近年來随着器官保存、组织配型技术的发展，以及新型 免疫抑制剂的广泛应用，肾移植患者的人肾短期存活率均获得了很大 的提高，但远期效果并没有得到相应的改善。急性排斥反应是导致移 植肾功能丧失的最主要的因素之一，但其分子机制目前尚未完全阐明。 自从1995年Krams首次提出细胞凋亡是急性排斥反应可能的机
8、制后, 凋亡相关分子在急性排斥中的作用成为国内外学者的重要研究领域。 凋亡相关分子在移植肾中的表达水平与急性排斥反应的发生、发展、 治疗效果及移植物的功能形态变化密切相关，研究这些分子的作用机 制有利于进一步降低急性排斥反应的发生率，促进临床肾移植的发展。1材料与方法1. 1研究对象及分组 实验组：1997年至2003年间肾移植术 后两周内在本中心诊断为急性排斥反应的移植肾穿刺标本30例，其中 男性18例，女性12例，年龄22-56岁，平均36岁；对照组：18例 正常供肾作为对照。1.2组织配型ABO Jfn.型：血型相同者20例，血型相容者10 例;群体反应性抗体(PRA): 26例为阴性,
9、另4例分别为15%、20%、 30%, 40%；淋巴细胞毒交叉配型试验：均为阴性(<10%)； HLA配型: HLA位点2个抗原错配4例，HLA位点3个抗原错配16例，HLA位点4 个抗原错配8例，HLA位点5个抗原错配2例。1.3免疫抑制剂的应用 术前l-2d 口服环抱素 A(CSA)4. 5-5. 0mg/(kg - d)加霉酚酸酯(MMF)1.5g/d；术前口服 MMF 2.0g/d、强的松(Pred)80mg；移植术中及术后l-4d应用甲基强的松龙 250-750mg/d.环磷酰胺100-200mg/d冲击治疗。术后当血肌酹降至 265. 2 u mol/L以下时开始口服CSA。
10、术后笫1天即开始口服MMF 1.5g/d, CSA 起始量 4. 5-5mg/(kg-d),强的松维持量 10-20mg/do1.4急性排斥的诊断和治疗1.4.1诊断标准临床上表现有尿量减少、体重增加、发热、 血压升高、移植肾区肿大和压痛；血尿素氮和肌酹持续升高，肾功能 进行性下降;B超检查:移植肾体积增大，皮质増厚，回声增强,Doppler 显示移植肾血液供应差、流速慢；同位素肾动态显示移植肾核素摄取 及分泌、排泄相均较差；排除其他类型的排斥反应；排除CSA的肾毒 性；肾间质及血管周围大量单核细胞浸润，肾小管周围淋巴细胞聚集, 有血管内膜炎；移植肾病理诊断为急性排斥反应。1.4.2急性排斥反
11、应的治疗 首先采用大剂量的甲基强的松 龙、环磷酰胺冲击治疗2-3d。甲基强的松龙冲击治疗无效时改用抗CD3 单克隆抗体(0KT3)或者抗胸腺细胞免疫球蛋白(ATG)。抗排斥治疗时间 7-10d,待排斥反应逆转后恢复三联免疫抑制方案。肾血管扩张药物的 应用：利尿合剂的使用：盐酸多巴胺20mg盐酸酚妥拉明10mg速 尿20-80mg、654-2 Wing,加入50g/L(5%)葡萄糖注射液500mL中静脉 点滴，每日1-3次;盐酸川穹嗪120mg加入50g/L(5%)葡萄糖注射 液或生理盐水250-500mL +静脉点滴，每H1次。这两种液体持续应 用至肾功能恢复正常。1. 5主耍试剂 鼠抗人Be
12、l 2单抗仃gGl)、鼠抗人Bax单抗 (IgG2b)、兔抗人FAS多抗(IgG)、兔抗人FAS L多抗(IgG)均为美国 Santa Cruz公司产品；鼠抗人穿孔索单抗(IgG)为深圳晶美生物公司 产品；鼠抗人粒酶B单抗(TgG2a),免疫组化SP染色试剂盒、DAB显 色试剂盒、中性树胶均为北京中山生物技术公司产品。1.6实验方法1.6.1常规病理技术 移植肾穿刺标本立即放入新鲜配制的 10%(体积分数)甲醛溶液中固定，12h后梯度酒精脱水，二甲苯透明， 石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察移植肾组织中主耍的凋亡细胞类型。所有组织均先按Banff 97分类标准进行诊断。1.6.2免疫组化染色
13、严格按照SP染色试剂盒说明书进行， 实验中每种指标均设置阳性和空白对照（以PBS代替一抗）。免疫组化 染色以出现明显棕黄色即为阳性结果，若DAB显色15min组织仍无着 色则为阴性结果。所检测蛋口表达半定量：:50%以上的肾小管呈阳 性表达；：25%-50%的肾小管呈阳性表达；+： 25%以下的肾小管呈阳 性表达。1.7统计学处理 用Wilcoxon两样本比较法进行统计分析， 用Spearman等级相关分析。统计分析利用SPSS10. 0软件进彳亍，以 P<O05为差异有统计学意义。2结果2. 1 Banff 97诊断分类1急性排斥反应组中，IA（明显的 I川质浸润，即25%以上实质受累
14、；中度小管炎病灶，即>4个单核细 胞/每小管横断面或10个小管细胞）占40%, IB（明显的间质浸润；严 重小管炎病灶，即>10个单核细胞/每小管横断面或10个小管细 胞）36.6%, IIA（轻度到中度动脉内膜炎）16.6%, IIB（严重动脉内膜炎, 管腔狭窄25%以上）6. 6%o2.2移植肾组织中的细胞凋亡HE染色可见，凋亡细胞的核 呈蓝黑色，胞浆为淡红色，单个散在地分布在组织中。表现为核染色 质致密浓缩，核碎裂等，可发现凋亡小体。依常见顺序排列为肾小管 上皮细胞、炎细胞、动脉壁平滑肌细胞、内皮细胞、肾小球系膜细胞、 移行上皮细胞。肾小管上皮细胞凋亡可与核分裂相伴出现，细胞
15、核碎裂 细胞趋向腔面或脱落于管腔中，主要见于近脚小管和直小管，集合小管 相对少见。炎细胞凋亡主耍为淋巴细胞和中性白细胞，见于肾间质或小 血管腔内，多为凋亡小体。浆细胞凋亡时胞浆红染、固缩,核碎片3-5 个。其他类型细胞凋亡主要表现为核碎裂。本实验中所有的标本均可 发现凋亡细胞，但以急性排斥标本中的凋亡细胞数目最多，形态学特 征也更为典型。2. 3移植肾组织中Bel 2/Bax蛋口的表达Bel2表达的阳性定位为胞浆及胞膜有棕黄色颗粒。按阳性程度，依次 为：肾小管上皮细胞(近曲小管为著)、移行上皮细胞、肾小球系膜细 胞、血管内皮和间质中单核淋巴细胞。在对照组中的表达以()为主 (42. 1%),急
16、性排斥标本则多为(+) (51.1%),组间比较有统计学意义 (P<O. 05),并且与组织病理变化呈负相关(r=-o. 286, P=0. 026) o Bax蛋白在所有标本中均有广泛的表达，定位于细胞浆，以()-() 为主，两组之间比较无统计学意义(P>0. 05) o2.4移植肾组织中穿孔素/颗粒酶B的表达100%急性排斥反 应的移植肾病理标本均表达穿孔素和粒酶B,二者的表达情况类似， 主耍定位于肾小管上皮细胞和间质淋巴细胞的胞浆和胞膜。急性排斥 组主要为()-()(分别为68%和70. 2%)；正常对照组主要为(+)(分 别为57. 9%和63. 2%) o组间比较差异均有统计学意义(P<0. 05, P<0.01),穿孔素和粒酶B的表达与病理分级呈止相关，以粒酶B 的相关程度较好(r = 0. 356, P<0.01)o2. 5 Fas/Fas
