《治疗性HPV16Z-Hsp65-E6E7无佐剂重组蛋白疫苗的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《治疗性HPV16Z-Hsp65-E6E7无佐剂重组蛋白疫苗的实验研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、治疗性HPV16Z-Hsp65-E6/E7无佐剂重组蛋白疫苗的实验研究摘要目的：研究治疗性HPV16 Z-Hsp65-E6/E7重组蛋白疫苗的抗肿瘤相关生 物活性。方法：通过淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发的细 胞免疫反应及反应强度；研究该疫苗对小鼠TC-1肿瘤细胞移植瘤的体内治疗作 用和对小鼠生存期的影响。结果：经检测证实该重组蛋白疫苗免疫小鼠后小鼠脾 淋巴细胞增殖明显，并可特异性地在体外杀伤TC-1细胞，能诱导特异性的细胞 免疫反应；动物体内抑瘤试验研究显示该疫苗对HPV16病毒转化的TC-1细胞小 鼠移植瘤有显著的治疗作用。结论：体外实验证实该疫苗有较强的免疫原性，能 激
2、发特异性细胞免疫反应；体内显著抑制HPV16转化的TC-1肿瘤细胞生长。治疗性HPV16 Z-Hsp65-E6/E7重组蛋白疫苗的初步研究证实该疫苗的进一步研究将 对HPV16病毒感染相关疾病的治疗具有实际应用价值。关键词人乳头瘤病毒16型;治疗性疫苗；宫颈癌The experiment study of TherapeuticAdjuvant-free proteinVaccineHPV16Z-Hsp65-E6/E7abstract Objective: To study the biological effects of the HPV16Z-Hsp65-E6/E7 fusion prot
3、ein vaccine on the tumor associated vi th HPV16 infection. Methods: We tested the cellular immune responsive intensity to the vaccine by the lymphocyte prol iferation and CTL response and studied the therapeutic effect of the vaccine on mouse TC-1 cel 1 transplanted cancer in vivo, and the influence
4、 on mouse 1 ifet ime Resul t s: The spleen lymphocytes f rom the C57BL/6 mouse immunized by the Hsp65-E6/E7 vaccine could be proliferated obviously in the presence of the protein and TC-1 tumor cel 1 could be lysed specifically by immune activated lymphocytes In vitro. The animal therapeutic experim
5、ent in vivo showed that the vaccine could suppress the growth of TC-1 cell transplanted tumor remarkably. Cone 1usions: The recombined vaccine could induce specific cellular immune response in vi tro and suppress HPV16 posit ive TC-1 tumor cel 1 growth obviously in vivo. The prel iminary study of th
6、e adjuvant-free vaccine confirmed that the further research and development of this vaccine may have the pract ical applicat ion value to treating the HPV16 correlat ive disease.key words: Human Papillomavirus 16 Therapeutic vaccine Cervica 1 cancerHPV与多种人类上皮来源的恶性肿瘤和不典型增生的发生和发展关系密切， 高危HPV16型的感染是女性宫颈
7、癌形成的主要原因1。在我国妇女宫颈癌组织 中HPV感染检出率大于99%,其中HPV16占60%以上2。世界范围内每年有40 多万新发宫颈癌病例，约20万人死于该病，位居女性肿瘤死亡人数的第二位3。 目前宫颈癌的治疗主要是手术和放疗，其治疗5年生存率仅50%左右，另外对宫 颈的早期病变和HPV感染相关的疾病的治疗尚缺乏理憩的方法。因此研制新的药 物用于治疗HPV感染尤其是HPV16型引起的相关疾病具有重要意义。本试验室前 期工作中在我国成功克隆了与山西省襄垣宫颈癌高发关系密切的HPV16Z株，并 经突变修饰去除该病毒E6/E7致癌基因中的致癌位点，构建并表达了 HPV16Z-Hsp65-E6/E
8、7融合蛋白治疗性基因工程疫苗4。本研究进一步观察该疫苗在体 外所诱发的细胞特异性免疫反应及在鼠体内的抗TC-1移植瘤生长的生物活性。1材料与方法1.1主要试剂RPMI 1640 駢 基（GIBCO）,小牛哉青（GIBCO）, LDH 检测试剂盒（PROMEGA ）, 小鼠IL-2 （四环），96孔培养板（NUNC ）。1. 2细胞株TC-1细胞系来源于鼠C57BL/6的肺上皮细胞,是经共转染HPV16 E6/E7和 活化的c-H-ras基因后转化而得到的HPV16 E6/E7阳性细胞株。本实验所用 TC-1细胞系由病毒所惠赠。L929细胞系来源于C57BL/6鼠肺上皮细胞,为NK 杀伤敏感细胞
9、，本室保存。上述的二株细胞系用含10%小牛血清的RPMI 1640完 全培养液，在37C, 5% C02条件下培养。1.3实验动物C57BL/6雌鼠，6-8周龄，体重16-20g,购自医学科学院动物研究所。1.4蛋白疫苗的制备Hsp65-E6/E7融合蛋白由本室制备，将Hsp65-E6/E7融合蛋白保存于PBS/20% 甘油中，-70C冻存。1.5小鼠的免疫及淋巴细胞的分离培养C57BL/6雌鼠6只分2组，每组3只，分别在颈侧皮下注射200 ug/0. 2mlHsp65-E6/E7融合蛋白（疫苗组）和0. 2ml缓冲液（对照组）o 14天后再次免疫， 方法、剂量和部位同第一次免疫，第二次免疫1
10、0天后脱颈处死小鼠，70%酒精中 浸泡3分钟。在无菌操作台上剪开腹部，取出脾脏，用玻璃注射器芯在200目不 锈钢网上轻轻研磨分离单个脾细胞。PBS冲洗不锈钢网，制成单细胞悬液备用。 取预先放置到室温的淋巴细胞分离液3山1,力叭15ml玻璃离心管中，将6-10ml 单细胞悬液轻轻加到分离液上，在水平离心机中2000rpm,离心20min,吸取中 间的白色界面层的淋巴细胞，PBS洗涤2次，计数，重悬于含10%的小牛血清RPMI 1640培养液中备用。1. 6淋巴细胞增殖试验用MTT法同时检测疫苗组和对照组的小鼠脾细胞的增殖。实验分为4组，分 别加入培养液（空白对照）、GST （无关蛋白对照组，终浓
11、度为lOOng/ml ）. Hsp65-E6/E7融合蛋白（实验组，终浓度为100u g/nil ）和Con A （阳性对照组， 终浓度为lOp g/ml ） 0每组设3个复孔，每孔加入40万脾淋巴细胞，总体积为 150u 1。在37C, 5%CO2条件下培养3天后，加入lmg/nil MTT溶液50u L 37C 孵育4-6小时后，用酶标仪测定波长为570nm时的吸光值（0D ）。计算公式：刺 激指数（SI ）=实验组0D值/对照组0D值。1.7特异性杀伤实验用LDH法测定小鼠脾淋巴细胞对靶细胞TC-1和L929细胞的杀伤作用。在圆 底96孔培养板中每孔加入1 X104靶细胞，然后分别加入不
12、同数量的效应细胞， 使效靶比为25: 1和12. 5: 1。同时设效应细胞自发释放孔，靶细胞自发释放孔和 靶细胞最大释放孔对照。37C孵育4小时，然后按LDH测定说明书操作。离心收 上清，取50ul上清转入另一个平底96孔板，加入50 u 1 LDH底物混合液，室温, 避光30分钟。每孔加入50n 1终止液，于波长490nm处测0D值。计算公式:杀伤率（）=实验孔释放一效应细胞自发释放一靶细胞自发释放靶细胞最大释放一靶细胞自发释放1.8 TC-1小鼠肿瘤移植模型的建立收集体外培养的TC-1细胞洗2次，调整细胞密度至6. 5X105 /ml0在小鼠 的胸前侧壁，每只皮下注射200 u 1 TC-
13、1细胞。从注射后第三天开始观察肿瘤的 生长情况，每2天观察一次。1. 9 Hsp65-E6/E7重组疫苗小鼠免疫治疗性实验28只荷瘤小鼠随机分为4组，每组7只。肿瘤接种后10天，进行第一次免 疫治疗。免疫治疗的3组小鼠分别皮下注射接种50 ug、100 ug和200 yg Hsp65-E6/E7融合蛋白，对照组小鼠只注射融合蛋白稀释液。每四天观察并记录 肿瘤的生长情况。第一次免疫治疗后的第14天，进行第二次免疫治疗，方法和 剂量同第一次免疫治疗。继续观察肿瘤生长情况，直到试验结束。肿瘤体积计算方法： 肿瘤体积二 长径X短径的平方/21.10统计学处理数据用XSD表示。使用spss软件包进行统计
14、学处理。两样本均值比较采 用t检验，生存期比较采用寿命表法，P0. 05为差异有统计学意义。2结果2.1 Hsp65-E6/E7重组蛋白疫苗诱导小鼠脾淋巴细胞增殖Hsp65-E6/E7重组蛋白疫苗对免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖有较强的刺澈作 用，为3.4;而对对照小鼠脾淋巴细胞的增殖作用刺激较弱，刺激指数为1.1, 如图1所示，二者差异有显著性意义（P0. 01 ） o无关蛋白GST对免疫和对照二组小鼠脾淋巴细胞刺激增殖作用均较弱，二组的差异无显著性意义。ConA对免 疫和对照小鼠脾细胞增殖都有强烈刺激作用，二组的差异无显著性意义。X2pu.rdE6/E72.2小鼠脾淋巴细胞的特异性杀伤作用特异性
15、细胞免疫在清除病毒和杀伤肿瘤细胞方面起重要作用，用小鼠脾细胞 直接进行杀伤肿瘤细胞试验可以反映免疫后体内的抗肿瘤能力。Hsp65-E6/E7重 组疫苗免疫小鼠的脾细胞对HPV16阳性TC-1细胞的杀伤明显高于对照组，在效 靶比为25: 1的情况下，杀伤率分别为13.28%和4. 26%,结果如图2所示，差异 有显著性(P0. 01 )意义。另外我们还检测了小鼠脾细胞对HPV16阴性L929细 胞的杀伤作用，发现免疫组和对照组杀伤率均很低，效靶比为25: 1时分别为 3.79%和2. 5%,差异无显著性意义。图2小鼠脾淋巴细胞的特异性杀伤作用2. 3 Hsp65-E6/E7蛋白疫苗在小鼠体内诱导
16、的特异性抗肿瘤作用在C57BL/6小鼠胸前侧壁接种1. 3X105 TC-1细胞。接种TC-1细胞4天时, 即可观察到肿瘤在小鼠皮下生长。10天时，肿瘤形成率达100%,肿瘤大小均匀， 体积约8mm3左右。分别在第1 0和24天进行两次免疫接种。对照组小鼠肿瘤生 长迅速。40天后，对照组小鼠由于肿瘤负荷过大开始死亡；而治疗组小鼠的肿 瘤生长受到抑制（图3）。在接种肿瘤细胞的第32天，对照组小鼠的平均肿瘤 为7. 5cm3,而治疗组的50ug. 100ug和200 ug3个剂量组的肿瘤体积分别为 4.1、1.6、0.2 cm3,疫苗对肿瘤抑瘤作用呈现显著的剂量-效应关系（与对照组 相比，3组的P0. 05）（图4）,特别是高剂量（ 200 ug/只）治疗组，7只小 鼠中的2只在第二次免疫后
