分子生物学基础实验实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理载体:要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行 繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就 叫载体（vector）载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件作 为基因工程的载体必须具备下列条件:（1）是一个复制子，载体有复制点 才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增 殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA 链上有1到儿个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的 插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc「）,抗 新霉素基因（Ne「）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个 标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来细菌质粒具备上述条件， 它是基因工程中常用的载体之一质粒（plasm id）是一种染色体外的稳定遗传因子,大小在1〜120kb 之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和 真菌细胞中质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒 定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息它可独立游离在细胞质内，也 可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的 许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）前者只在细胞周期的一定 阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制每个细胞内只含有1个 或几个质粒分子后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里， 它有许多拷贝，一般在20个以上通常大的质粒如F因子等，拷贝数较 少，复制受到严格控制小的质粒，如ColE I质粒（含有产生大肠杆菌 素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制在使用蛋白质合成抑制 剂一氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColE I质粒继续复制 12-16h,由原来20多个拷贝可扩增至1000-3000个拷贝，此时质 粒DNA占总DNA的含量由原来的2%增加到40%—50%质粒 pBR322> pUC19就是由ColE I衍生的质粒所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩 增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA采用溶菌酶可破坏菌体细 胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污 剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时 易被沉淀出來，而质粒DNA则留在清液中。
用乙醇沉淀、洗涤，可得到 质粒DNAo质粒DNA的相对分子量一般在1 06-1 07范围内，如质粒pBR322 的相对分子质量为2.8x 1 0霜质粒pUC19的相对分子质量为1.7x106o 在细胞内，共价闭环 DNA （covalently closed circular DNA,简称 cccDNA）常以超螺旋形式存在如果两条链中有一条链发生一处或多处 断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA,简称ocDNA）0在电泳时，同一质粒如以cccDNA 形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自 制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带二、实验目的1. 掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法2. 了解制备原理及各种试剂的作用三、实验材料和试剂材料：人肠杆菌E.coli,质粒pegf 试剂：1. LB培养基:1Og/L胰蛋白际5g/L酵母提取物，10g/L NaCI,用 NaOH调pH至7.3左右如固体培养基则添加15g/L琼脂2•溶液I （ pH8・0G・E.T缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖， 25mmol/LTris-HCI, 10mmol/L EDTAo 灭菌后存放。
3•溶液II （0.2mol/LNaOH（内含 1%SDS））：预先配制 1 %SDS母液, 临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH, 4C保存4. 溶液III（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、滋 酸11.5mL> 双蒸憾水28.5mLo5•酚/氯仿液（V/V=1/1）：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊 醇，使其体积比为24:1 ,然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用 0.1mol/LTris-HCI （pH7.6）抽提儿次以平衡这一混合物，于棕色瓶中 存放，并在上而覆盖等体积的0・01 mol/LTris-HCI（pH7.6）, 4C保 存6 •无水乙醇7.70%乙醇8. pH8.0 TE 缓冲液：10mmol/LTris-HCI、1mmol/LEDTA,其中含 RNA 酶 20pg/mLo仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离 心机、台式小型振荡器、EP管（1.5mL微量离心管）、加样器（20uL〜 ImL）、吸头一）培养细菌将带有质粒pegf的大肠杆菌接种在含50|jg/mL卡那霉素（Ka+）的 LB液体培养基中，37C振荡培养过夜。
注意：添加K才时，须待LB培 养基冷却到50C左右方可加入―）从菌落中快速提取制备质粒DNA1. 取1,5mL（750uL取两次）菌液置于1,5mL Ep管中，1 OOOOrpm 离心3mino2. 弃上清，重复步骤1,弃上清，加入15O|JL GET缓冲液，在涡旋 混合器上充分混匀3. 加入300|jL新配制的0.2mol/L NaOH（内含1%SDS）,加盖，颠 倒（不要振荡）3次，使之混匀4. 加入225|JL冰冷的乙酸钾溶液加盖后，颠倒（不要振荡）3次使 之混匀5. 10OOOrpm离心5min,上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如 上清液浑浊则需重新离心一次6. 于上清液中加等体积氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min,小 心吸取上清液，转移至另一支1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的 白色蛋白薄层吸出7. 向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，用离心机于10000rpm离 心5min小心吸去上清液8. 用0・5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心5min,除尽 乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸山上)，备用9•用20ULTE重新溶解DNA,置于空保存，供电泳使用。
贮存于-20C 备用，可长期保存实验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定、实验原理测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法1. 紫外分光光度法DNA或RNA定量时，应在260nm和280nm两个波长下读数根据计算 在260nm波长下，每lug/inL DNA钠盐的A值为0. 20,即在A缈二1时，双 链DNA含量为50ug/mL,单链DNA与RNA含量为40ug/mL,单链寡核昔酸 的含量为33 ug/inLo双链DNA含量=A260 X 50 X稀释倍数(ug/mL)RNA 含量=A26o X 40 X 稀释倍数(ug/mL )单链DNA含量=A26oX 33X稀释倍数(ug/mL)此外还可以根据260nm和280nm的读数间的比值(A260/A2G估计核 酸的纯度2. 琼脂糖凝胶电泳法根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分 子后在紫外下显荧光而荧光强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的 标准样品表2-1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度电泳后 的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5-10ngDNA,就可以从照 片上比较鉴别由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可, 所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。
表 2 — 1 ADNA/ Hind TTT44 DNA 片断片 段碱基对数目/kb相对分子质量DNA含量/ %DNA含量/(ng/mg)123.13015.0x 10647.7476.929.4196.12x 10619.4194.136.5574.26x 10613.5135.244.3712.84x 106989.952.3221.51x1064.847.962.0281.32x1064.241.870.5640.37x 1061.111.680.1250.08x 1060.32.6二、 实验目的1. 从以上实验中提取到的质粒DNA,为了能作下一步的酶切，连接及 转化实验，必须测定DNA的纯度、含量以及分子量大小2. 本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测DNA、含量与相 对分子质量大小三、 实验材料和试剂材料：自制的质粒DNA、ADNA/ H/nt/TTLo试剂：1 ・标准 DNAmarker（ADNA/ Hind III）2•限制性内切酶HindlW 1 OX缓冲液3. 酶反应中止液：0.2 5%漠酚蓝（含40%蔗糖），已配好4. 澳化乙锭染液（EB）：使用前稀释1000倍，母液已配好。
注意：EB 是一种诱变剂，配制和使用时应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌 而或地而上！使用后立即用大量的水冲洗干净5・ 0・5xTBE缓7中液：Tris2.18g、硼酸 1.10g、 EDTA-Na20.14g 蒸啊水定容至400mLo可配成5xTBE母液，使用时稀释10倍即可6. 0.7%琼脂糖仪器：37C水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf 架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管（1.5mL）,加样器（20uL〜ImL）、吸头四、实验操作（一）质粒DNA的酶解1. 新提的质粒，在10uL的体系中用单一酶（如EcoRI ）进行处理，即:质粒DNA10 X缓冲液EccR I6. 5uL2. 37C,保温 30mino3. 加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应各酶解样品 于冰箱中贮存备用二）琼脂糖凝胶板的制备1. 琼脂糖凝胶的制备称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入10OmL TBE缓冲液，瓶 口倒扣一小烧杯，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶 解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馅水，使其终浓度为1%2. 胶板的制备将有机玻璃内槽洗净、晾干。
取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘 封好，形成一个边脚模子注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边 上，不能留空隙将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板（一般称之为梳子）， 将冷却至65C左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度， 使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层室温下 静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔岀样品槽模板，撕去胶带纸，胶板 上即形成相互隔开的样品槽将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5xTBE电泳缓冲液，以盖 过胶板为宜胶板内的样品小槽3. 加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一 个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污 染加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每 个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右4. 电泳加完样品后应立即通电，进行恒压电泳在低压条件下，线形DNA 片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大 分辨率，电场强度不应高于5V/cm0当漠酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿。