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1、食管癌组织微环境对树突状细胞的影响【摘要】目的：探讨食管癌组织匀浆上清液体外模拟肿瘤微环 境对人树突状细胞(DC)分化发育的影响，揭示肿瘤免疫逃逸机制，为 DC疫苗的应用提供理论基础。方法：制备新鲜食管癌及癌旁组织匀 浆上清液,ELISA检测其VEGF A含量。密度梯度离心法分离人外 周血单个核细胞，含rhGM CSF和rhIL 4RPMI1640培养液诱导 DC,第2天在继续诱导DC基础上设食管癌匀浆上清组、癌旁匀浆 上清组、VEGF A组，均隔天半量换液，第4天加入食管癌细胞株 EC9706抗原，第6天加入脂多糖，第8天收集各组细胞。观察DC形 态，流式细胞术(FCM)检测免疫表型,RT
2、PCR检测CDla表达,CCK8检测T细胞增殖率及杀伤率。结果：食管癌组织匀浆上清VEGFA 含量(0.9870.319) u g/L明显高于癌旁(0.1520.105) u g/L, P0.05J;食管癌匀浆上清组细胞形态明显受到抑制，CD86分子阳性 率()与正常DC相比由698降为4211、CDla由5612降为 2712、CDllc 由 2113 降为 1813(P0.01), CDla 基因几乎无表 达，刺激T细胞增殖率(%)由112.57.2降为70.23.5(P VEGFA 10 ug/Lo隔天半量换液。第4天各组加入EC9706抗原，第6 天加入脂多糖5 Pg/L,笫8天收集细
3、胞，进行形态观察，免疫表型分 析，RT PCR以及混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）和体外杀伤反应。1.2.5 FCM检测细胞免疫学表型 分别于培养0 d （PBMC贴壁3 h 去除悬浮细胞后）、8d,收集细胞PBS洗2遍。10g/L多聚甲醛固定 5 min, PBS洗1遍。用PBS调细胞密度为1 X 109/L,按20 u L/106 个细胞加入荧光标记的mAb（0d细胞检测CDla CD86 CDllc、 CD80、CD83及HLA DR; 8 d细胞检测CD86、CDllc及CDla）4C 冰箱避光孵育30 min后加入PBS 1 mL,吹打
4、均匀,1 000 r/min,离心5 min,弃去未结合的多余抗体。每管加入1 mLPBS巫悬,2 h内上机检 测。1.2.6 RT PCR各诱导组细胞总mRNA的提耽弃掉培养液, 用PBS洗2遍，在24孔板里加入TRIzol 1 mL,吹打均匀（呈黏稠状）, 室温静置5 min。转入无RNA酶的EP管中，加225 L氯仿，盖帽, 剧烈振荡1530 s,室温静置3 min, 4C, 14 000 r/min,离心15 min。 吸取上清移至新EP管，加异丙醇0.5 mL,充分混匀,4C,12 000r/min, 离心10 mine弃上清，加DEPC水配制750 mL/L乙醇1 mL,振荡洗 涤
5、沉淀,4C,7 500r/min,离心5 min。得 mRNA,按照一步法RTPCR试剂盒说明书操作，获得目的基因DNA片段。CDla引物：（5primer）: 57 GCTGCACTCTGGAAAGGTCT 3（3 primer）: 5 CCAAAGCGCAAGACCTATCA 3（扩增片段长度为 601 bp）; GAPDH 基因作为内参照（5 /primer）: 5 AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG 3，（3 primer）: 5 CTTGACAAAGTGGTCGTTGAGG 3（扩增片段长度为 915 bp）。1.2.7 CCK 8检测致敏DC诱导MLR及特异性CTL对EC
6、9706 细胞杀伤效应（1）致敏DC的获取：DC培养第4天，各组加入终浓度 为100 mg/L EC9706细胞抗原，第8天收集DC,即为负载EC9706抗 原的DCo（2）MLR:各组负载EC9706抗原的致敏DC为刺激细胞，同 种自体T细胞为反应细胞，两者按1 ： 20比例混合，以1 X 104个/孔 种于96孔板，分为对照组（静止T细胞）;DC组（正常DC+T细胞）；食 管癌匀浆上清组（食管癌匀浆上清诱导DC+T细胞）；癌旁匀浆上清组 （癌旁匀浆上清诱导DC+T细胞）;VEGF A组（VEGF A诱导DC+T 细胞）。每组设6个复孔，混合培养72 h, CCK 8试剂盒检测T细胞 增殖率
7、。（3）致敏DC诱导特异性CTL的产生：同种自体T细胞与各 组致敏的DC按20 ： 1比例混合培养72 h,激活为CTLo （4）细胞毒性 实验：将各组CTL和静止T细胞，按效应细胞：EC9706为30 ： 1比 例混合，分为靶细胞对照组（EC9706）;效应对照组（静止T细胞+ EC9706）; DC组（DC诱导的CTL+ EC9706）; D组：食管癌匀浆上清组 （食管癌匀浆上清组DC诱导的CTL+ EC9706）;癌旁匀浆上清组（癌旁 匀浆上清组DC诱导的CTL+ EC9706）; VEGF A组（VEGF A组 DC诱导的CTL+ EC9706）o设每组6个复孔,1X104个/扎细胞悬
8、液 200 u L种于96孔板，培养72 h, CCK 8法检测对EC9706细胞杀 伤率。（5）CCK 8检测：加入10 u L/孔的CCK 8试剂，培养2 h, 于酶标仪450 nm处测各组A值，计算T细胞增殖率和杀伤率。其计 算公式如下：T细胞增殖率二实验组A值/静止T细胞组A fl.X 100%; 细胞杀伤率=（效应对照组A值实验组A值）/靶细胞对照组A值X 100%o1.2.8统计学分析采用SPSS12.0统计软件，进行两组One WayANOVA分析，以xs表示。2结果2.1 ELISA检测食管癌及癌旁组织匀浆上清VEGF A含量检 测15例食管鳞癌及癌旁组织匀浆上清液，结果显示癌
9、旁匀浆上清组 A rt 0.2030.089, VEGF A 浓度 0.1520.105 P g/L;癌上清组 A 值 08970.251, VEGF A 浓度 0.9870319 Pg/L,两组比较 Pv0.05, VEGF A含量有统计学意义。2.2形态学观察PBMC去除悬浮细胞后，镜下观察细胞贴壁，体 积小。诱导2 d,部分贴壁细胞变形，伸出小突起；第4天，正常DC 组细胞表面突起更加明显，并且交织在一起，VEGF A组与癌旁匀 浆上清组细胞形态与正常DC组相似，而食管癌匀浆上清组细胞形态 变化较小，仅有个别细胞伸出突起，细胞体积小于正常DC组细胞; 第8天，正常DC组、VEGF A组与癌旁匀浆上清组细胞逐渐增 大变圆，高倍镜下细胞周围可见毛刺状突起，部分细胞悬浮，呈成熟 形态，而食管癌匀浆上清组大圆细胞少，呈发育迟缓状态(图1)。2.3
