《组织学技术的基本理论和技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《组织学技术的基本理论和技术（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、组织学技术的基本理论和技术组织制片分类一、超活体染色制片二、活体染色制片三、分离制片法四、涂片法五、印片法六、整装片七、磨片法八、切片法九、血管注射法十、整装切片法组织制片技术及其神经组织的制片技术一、动物麻醉法1.乙醚吸入麻醉法2.戊巴比妥钠或乌拉坦注射麻醉法3.空气栓塞4.直接杀死法二、动物取材（一）动物选择（二）组织取材的方法神经系统的取材1.脊髓2.神经纤维3.大脑和小脑三、固定和固定液（一）固定的目的和意义:目的：1、 能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。2、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。3、 使组织硬化，便于切块。4、
2、对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。5、 保存好大体标本。 6、 可增强染色的作用意义： 组织经一系列的处理后，就必须进行固定，当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性
3、物的判断。（二）固定的方法1.小块组织固定法2.局部组织固定法3.整体注射固定法4.蒸汽固定法三、固定和固定液（三）组织固定与温度的关系Bernard经过一系列的研究后认为，肝、肾、肺的最佳固定温度是70，和77，因为各种组织的结构不同，成分不一，电子密度不一样，因而固定所需要的温度也不样。我们的实验认为，65左右的温度可适合于各种组织，条件是固定取小块材料，时间在截取3-4min。（四）固定应注意的问题1、 组织固定越新鲜越好。 2、 组织固定，组织块不宜过大。 3、 对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。 4、 组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。 5、 固定液的量要充分。 6、 特殊病
4、例或特殊物质应选择特殊的固定液。 7、 组织的第二次固定或后固定。 （五）固定液： 固定液必须具备的性能：固定液必需要有较强的渗透能力，能迅速地渗入组织内部，不会使组织过度收缩或膨胀，并且能使组织内易观察的成分可以凝固为不溶性物质，能使组织达到一定的硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲和力。 固定液的分类单纯固定剂1.福尔马林2.乙醇3.丙酮4.氯化汞5.重铬酸钾6.铬酸7.苦味酸8.锇酸9.醋酸10.三氯醋酸固定液的分类混合固定剂1.甲醛混合固定液2.酒精混合固定液3.丙酮混合固定液4.氯化汞混合固定液5.重铬酸钾混合固定液6.铬酸混合固定液7.锇酸混合固定液8.苦味酸混合固定液9.三
5、氯醋酸混合固定液四、组织冲洗、脱水与透明（一）组织冲洗1.简易流水冲洗法2.一列式玻瓶或水槽冲洗法3.倒置冲洗法4.酒精洗涤法 组织与酒精 1：20 1224小时 50%70%酒精，更换36次，每4小时更换一次，可在70酒精中较长时间保存（二） 组织脱水1.脱水剂 乙醇 丙酮 正丁醇 二氧氯环 2.脱水方法（三）组织透明1.二甲苯2.甲苯3.苯4.香柏油5.三氯甲烷（氯仿）6.安妮林油五、组织浸蜡与包埋（一）浸蜡 软蜡：熔点：4554 硬蜡：熔点：56 58 ，6062（包埋）（二）包埋1.石蜡包埋操作过程 制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡
6、，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。 常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋。 2.石蜡包埋注意事项1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再60
7、C左右。 2.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。3.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宜。4.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。6.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块
8、内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。8.石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。六、组织切片1.石蜡切片法2.火棉胶切片法3.冰冻切片法七、染料与染色（一）染色简史（二）染料分类1.天然染料 苏木精 胭脂红（卡红） 地衣红2.人工合成染料 八、常规染色技术H-E染色的步骤和方法常规HE染色步骤 （1）二甲苯（） 5-10 min (2) 二甲苯（） 5-10 min (3) 95%乙醇（） 1-3 min（4）95%乙醇（） 1-3 min（5）80%乙
9、醇 1 min（6）蒸馏水 1 min（7）苏木精液染色 5-15 min (8 ) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s (9) 1%盐酸乙醇 1-3 s (10) 稍水洗 10-30 s (11)促蓝液返蓝 10-30 s (12) 流水冲洗 10-15 min（13）蒸馏水过洗1-2 s (14) 0.5%曙红液染色 1-3 min (15) 蒸馏水稍洗 1-2 s (16) 80%乙醇稍洗1-2 s (17) 95%乙醇（） 2-3 s (18) 95%乙醇（）3-5 s (19) 无水乙醇 5-10 min (20) 石炭酸二甲苯 5-10 min (21) 二甲苯（） 2 min (22
10、) 二甲苯（） 2 min (23) 二甲苯（）2 min (24) 中性树胶封固注：第（10）、（11）步可省去，（12）步冲水时间需延长至20-30min。第（20）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定 1030 s（2）稍水洗 12 s（3）苏木精液染色（60）3060 s（4）流水洗去苏木精液 510 s（5）1%盐酸乙醇 13 s（6）稍水洗 12 s（7）促蓝液返蓝 510 s（8）流水冲洗 1530 s（9）0.5%曙红液染色3060 s（10）蒸馏水稍洗 12 s（11）80%乙醇 12 sH-E染色应注意的问题（1）取材,提前配好各
11、种固定液,并备有大量原液备用,取材后立即整修组织块,换固定液后继续固定。 （2） 取消化管时应注意的问题:因为消化管的粘膜上皮容易破坏和自溶,以往取材多为小片块,而且在外力(手压、刀切)作用下易造成粘膜损坏和肌层收缩.因此我们采用取大片及长段组织固定,将剖开的消化管贴在滤纸上.因消化管管壁薄,大片及长段固定不影响固定液的渗透,固定效果理想,然后再取未受损部位组织脱水,包埋,保存。（3） 消化管部位以空腹取材最为理想,尽量避免冲洗,特别是胃的壁细胞在空腹时胞质着色非常鲜亮。（4）载玻片和盖玻片的处理:载玻片最好在无水乙醇中浸泡1224hr,以达到彻底脱脂的目的,用前再用的确良白布擦净;盖玻片必须
12、在清洗液中浸泡24hr后清水冲洗,浸无水乙醇数小时后用尼龙绸布擦净。（5）伊红染液的浓度:以往常用0.5%1%的伊红染液,此浓度脱色时间长,可以采用 95%乙醇450ml+1%复制伊红乙醇溶液50ml的稀释液染色。（6）封片:将切片从二甲苯中取出后,用尼龙绸布将组织周围的二甲苯擦净,组织片避免干燥,滴少许中性树胶,将盖片在酒精灯上烤一下,以达到蒸发空气中水份及将盖片上肉眼不易观察到的污物烧掉,并有利于中性树胶的均匀扩散。（7）磨刀:在自动磨刀机上加机油磨刀,磨后擦净刀上的污垢即可切片.免去鐾刀这一工序 ,因经过鐾刀皮鐾刀有时使刀口损坏,(鐾刀皮用时间长后,刀皮二边上翅或鐾刀角度稍有不当,用力不匀等均能造成刀口损坏)。细胞与组织的特殊染色技术概述细胞学特染技术神经节神经细胞内高尔基复合体的显示 1.Da-Fano氏高尔基复合体显示法 2.Mcdonald氏高尔基复合体改良法 3.Cajal硝酸铀高尔基复合体显示法 4.高尔基复合体Elftman氏直接浸银法 5.高尔基复合体锇酸浸染法神经组织一、神经组织的取材和固定二、常用染色法三、神经组织染色注意事项神经细胞
