Chapter 7 植物的胚胎培养 胚胎培养：指胚及具胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术雌蕊的主要部分是子房，子房的胚珠中产生胚囊，并在成熟胚囊中产生卵细胞，胚珠是子房中的重要结构胚发育和种子结构合子发育成胚珠被发育成种皮受精极核发育成胚乳 1904年Hanning首次成功培养了萝卜和辣根菜的胚，提前萌发形成幼苗 1924年Dieterich指出在knop培养基中成熟的胚能正常生长，而未成熟胚越过正常胚的发育过程直接长成幼苗 Laibach首次证实了胚胎培养在实用上的重要价值一、胚培养的意义 1.用于胚的挽救 2.打破种子休眠 3.克服珠心胚的干扰 4.诱导胚状体及胚性愈伤组织 5.种子生活力的快速测定二、离体胚培养的发育方式合子胚发育途径脱分化形成愈伤组织早熟萌发成熟胚未成熟胚维持胚的生长，进行正常的胚胎发育成熟，完成胚胎发育的全过程正常发育形成小苗2.1 按正常胚胎发育途径形成植株2.2 脱分化形成愈伤组织离体胚小植株愈伤组织激素浓度高胚状体或不定芽分化培养基2.3 胚“ 早熟萌发”畸形苗发育不正常而死（即胚性发育）未成熟幼胚分离变异体离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生过程中的若干阶段，直接长成幼苗。
三、胚培养方法 1.成熟胚的培养 成熟胚：一般指子叶期后至发育完全的胚1-1、材料的消毒与接种健壮优良的个体自交种或杂交种子，常规消毒灭菌，剥离胚1-2、培养基 大量元素和微量的无机盐为基本成分谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长植物天然浸提物（YE）促进胚生长硫氨素促进胚根的伸长生长素低浓度促进胚的发育（胚根）赤霉素促进有后熟作用的种子萌发1-3、培养条件 pH一般为5.26.312小时光照和25C，热带兰花杂交种胚30C附加成分2.原胚的培养 原胚：指未成熟的幼胚 一般胚龄越大，成功率越高；胚龄越小，成功率越低 2.1 培养方法 2.1.1 取材：子房 2.1.2 常规表面消毒 2.1.3 在高倍显微镜下剥离幼胚，接种于培养基 2.1.4 送入培养室培养2.2 原胚培养的条件 未成熟的幼胚，当它在胚囊里生长时，不仅依赖于周围细胞中的代谢，而且依赖于周围胚乳消耗的养料与成熟胚的相对自养性比较，幼胚则完全是异养的，在离体情况下，要求更复杂的培养基除了一般的无机盐成分外，还要加入微量元素和各种生长辅助物质胚龄越小，要求的培养基成分就越复杂2.2 原胚(幼胚)的培养的条件 2.2.1 无机氮： 2.2.2 渗透压： 2.2.3 复杂的天然提取物： 2.2.4 活性炭：包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；蔗糖，8%-10%，不同发育期，渗透压不一样，初期高（WHY）。
因为自然条件下，原胚被一层高渗液体包围着椰乳 CM有促进幼胚生长和分化的作用吸附有毒物质2.2.5 有利幼胚培养的因素胚乳看护培养，利于原胚的生长有明显的促进作用胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要：胚柄促进生长的活性，心形早期活性最高而且保留胚柄减少对胚的直接损失3.影响胚培养成功的因素（1）培养基 Tukey、Randolph、Cox、White、Rijven、Rappaport、Rangaswamy、Norstog、MS、B5、Nitsch （2）生长调节物质 （3）光温条件四、胚珠培养 1.培养方法：从花中取出子房，进行表面消毒，在无菌条件下进行解剖，取出胚珠放在培养基上培养2.离体胚珠培养成功的关键 （1）胚的发育时期：发育到球形期的胚珠比较容易培养成功 （2）胎座和子房的影响：胚珠带有胎座或部分子房时，即使是受精不久的胚珠，也容易培养成功 （3）培养基的附加成分：添加某些生长物质或天然混合物，对许多植物的胚珠培养是有效的五、子房培养 子房培养：指授粉或未授粉子房的离体培养一）培养方法 未授粉子房往往不需要灭菌，在无菌条件下直接剥离子房接种即可；而受过精的子房，仍需进行表面灭菌，一般在5%次氯酸钠盐溶液中消毒10min，然后用无菌水冲洗。
培养基无严格要求，但应添加适当有机成分和生长激素培养温度2227，需要不太强的光照二）子房植株的起源 子房中存在两种细胞性细胞和体细胞它们都可产生胚状体或愈伤组织，其后代会出现不同倍数性的植株若要通过子房培养从大孢子产生单倍体植株，必须设法控制不同倍数性组织中的细胞分裂三）影响培养成功的因素 要性细胞或体细胞通过诱导胚状体或愈伤组织，并分化成植株，对培养基的成分应有一定的要求六、试管受精 试管受精(test tube fertilization)：子房或胚珠培养在育种上的一种应用指在无菌培养条件下培养离体的子房或胚珠和花药，萌发花粉产生的花粉管进入胚珠，从而完成受精过程的技术一）操作方法 1.花粉收集 2.剥取子房或胚珠 3.离体授粉受精 4.将授粉受精后的子房移到Nitsch固体培养基上培养 5.胚培养二）影响试管受精成功的因素 1.柱头和花柱的影响柱头是某些植物受精的障碍 2.胎座的影响带有胎座有利于试管受精成功 3.培养技术要保证花粉发芽率选取合适的培养基，掌握好接种时的胚珠发育时期和授粉时间思考题 1、如何剥离幼胚？ 2、为什么幼胚比成熟胚培养要求的培养基成分复杂？ 3、胚胎培养技术在育种工作中有哪些应用？Chapter 8 植物的胚乳（三倍体）培养 三倍体基本特征： 1.由体细胞体积增加引起的巨大性； 2.由细胞减数分裂过程紊乱造成的不育性。
三倍体选育途径 1.自然选择，选择群体小，选择随机性大 2.利用四倍体与二倍体杂交，需时长，而且易出现非整倍体和遗传性状不良的个体 3.选择或诱导2n配子，与正常异性配子杂交易出现非整倍体或多倍体 4.体配融合后经培养可获得三倍体技术要求高，难度大 5.通过胚乳培养获得三倍体植株胚乳培养的历史 1933年，Lampe和Mills进行玉米胚乳培养的尝试 1949年，LaRue首次由未成熟胚乳建立起不断生长的愈伤组织 1973年，Srivastava由罗氏核实木的成熟胚乳培养中获得三倍体胚乳再生植株二、胚乳愈伤组织的建立 无论是未成熟还是成熟胚乳，都需要首先经历愈伤组织阶段，然后才能分化植株 经过一段时间培养的胚乳，首先体积增大，然后或是由胚乳的表面的细胞，或是由其内层细胞分裂形成原始细胞团，继而由原始细胞团发展成为肉眼可见的愈伤组织胚乳愈伤组织的发生及其诱导频率主要受以下几个因素的影响1.胚乳发育时期的影响 处于发育早期的胚乳，不仅接种时操作不便，而且愈伤组织的诱导频率很低 处于旺盛生长期的胚乳，在离体条件下最容易诱导产生愈伤组织 在一般情况下，接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低，甚至不能产生愈伤组织。
2.培养基与激素的影响 常用培养基有White、LS、MS、MT，其中以MS使用频率最高为了促进愈伤组织的产生和增殖，经常在培养基中添加一些有机物 植物激素对胚乳愈伤组织的诱导和生长起着十分重要的作用 在培养基中一定种类的生长素和细胞分裂素的合理搭配，在效果上显著优于使用单一的生长素和细胞分裂素3.胚在胚乳培养中的作用 在胚乳培养中是否必须有原位胚的参与，主要和接种时胚乳的生理状态（或胚乳年龄）有关 未成熟胚乳，尤其是处于旺盛生长期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无须原位胚的参与就能形成愈伤组织 胚在萌发时产生某种物质，对胚乳产生活化作用，在利用原位胚对成熟胚乳进行活化时，活化所需时间长短因植物种类不同而不同 通过内源激素和外加生长调节物质的调控，成熟胚乳也可以摆脱原位胚4.其他因素的影响 糖：多数需蔗糖35% 温度：25 光照、pH值因物种而异三、由胚乳愈伤组织再生植株1.器官发生途径 在被子植物胚乳培养中，最早出现器官分化的是大戟科植物巴豆和麻风树 在单子叶植物中，最先从水稻中通过未成熟胚乳培养得到完整植株 在胚乳愈伤组织分化过程中，有些植物在对激素种类的要求上表现了严格的选择性 有机添加物对胚乳愈伤组织茎芽分化的效果因植物种类不同而异。
对大部分植物来说，只有经过诱导生根才能获得完整的胚乳再生植株2.胚胎发生途径 通过胚胎发生途径获得胚乳再生植株的首例是柑橘的胚乳培养四、胚乳再生植株的染色体倍性变异 造成胚乳细胞在培养中染色体数不稳定的原因可能有： 胚乳的类型 胚乳愈伤组织的发生部位 培养基中外源激素的种类和水平 继代培养时间的长短五、胚乳培养的应用 无籽 营养生长好 遗传学上可获得三体 研究某些天然产物Chapter 9 单倍体细胞培养一、基本概念和发展简史 植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半，叫做单倍体细胞(haploid cell) 花粉培养和花药培养(pollen and anther culture) ：指花粉在合成培养基上改变其正常发育和机能，即不经过受精过程发生的细胞分裂，而由单个花粉粒发育成完整植株的技术 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株，叫做单倍体植物(haplobiont)1.名词1953年：Tulecke由银杏花粉培养得到可继代 培养的单倍体组织1963年：Yamada由紫露草属植物的花药培养中分离 得到了单倍体组织;1964年：Guha&Maheshwari毛叶曼佗罗成熟花药培 养出胚状体，进而获得单倍体植株。
1967年：Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植 株；目 前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱 导成植株2、花药培养简史3.花药培养与单倍体育种 花药培养的主要目的，是培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源 利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子 构建永久性分离群体双单倍体系（Doubled haploid)，用于基因定位大大缩短育种周期二、单倍体起源和遗传行为（一）单倍体起源1、单倍体：具有配子体的染色体组成的孢子体1） eg: 正常个体 单倍体 水稻 2n2x24 n12 马铃薯 2n4x48 n24 小麦 2n6x42 n21 区别： 单倍体 一倍体 2）自发形成的单倍体：（频率10-510-4 ） i、孤雌生殖：未受精卵cell 单倍体ii、孤雄生殖：eg： 金鱼草、烟草iii、无融合生殖： 助cell 单倍体 反足细胞 单倍体 3）人工诱导单倍体：i、延迟授粉；ii、远缘杂交：利用杂交后亲本配子无法融合的 现象淘汰一个亲本；iii、剥离未受精子房及胚珠培养；iv、花药培养及花粉粒培养； 1964 Guha 茄科 花药培养 十字花科 禾本科（二）单倍体的减数分裂行为 一倍单倍体减数分裂不正常，具有一定亲源关系的染色体可以部分配对。
起源于同源或异源多倍体的多倍单倍体减数分裂时染色体的 行为有很大差异三、单倍体的应用价值 花粉或花药培养诱导单倍体的技术在应用上有一定优势，因为它技术简单；对一些植物来说易于诱导未成熟花粉的分裂；可以进行大群体研究；可以迅速而大量地产生单倍体1.在植物育种中使后代迅速纯合；eg： a高产 B抗旱 AB aB AABB AaBB aaBB AABB aaBB 1 : 2 : 1 1 ： 1ABaB单倍体诱导有性繁育 加快育种进程 eg: F1 AaBb AABB aabb 1/16 单倍体诱导 染色体组2n 则为 1 / 2 1 / 2以水稻为例：杂交育种 固定性状，获得等基因纯系 810年若采用单倍体培养加速杂合体纯合化 23年2.提高选择效率；可排除显隐性干扰，发现隐性突变体以水稻为例：2n=24 杂交育种 单倍体育种 2n n 1/16 777 716 1/4 096 3.排除杂种优势对后代选择的干扰；4.遗传研究的良好实验材料；5.突变体的筛选；6.消除致死基因；7.选育新型自交系；8.遗传转化的受体材。