Mar. 5, 2013T淋巴细胞转化试验 主 要 内 容 实验分组及材料 实验原理 检测方法 主要操作步骤 结果判定实验分组及材料 分组：每组分组：每组4 4人人原 理Lymphocytes(B/T)mitogensSpecificity AgProliferationtransformationlymphoblastNucleic AcidProtein T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖 有丝分裂原 有丝分裂原（mitogen）来自植物蛋白或细菌产物，它能与多种细胞膜糖类及寡糖基分子结合，后者为丝分裂原受体、结合后能促使细胞活化和诱导细胞分裂 T和B细胞表面都有分裂素受体，在体外可非特异性刺激静止淋巴细胞向淋巴母细胞转化这种转化细胞DNA合成增加，出现细胞体积增大，胞浆增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化 常用的丝裂原 T cell proliferation 植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA)(人T）刀豆素A（concanavalin, ConA）（鼠T）美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM) B cell proliferation脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)(鼠B）金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A,SPA)（人B）美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)常用的检测方法 形态学观察法3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）本次实验采用 MTT法形态学检测方法 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的34倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。
根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率： 3H-TdR掺入法G0G0G1G1有丝分裂原特异性抗原S SPr,RNA,DNA前体物质DNANew DNANew DNA3H-TdRTdRTdR3 3H-TdRH-TdRcpmcpm T细胞在PHA或ConA刺激下转化为淋巴母细胞，同时DNA和RNA合成明显增加，此时将同位素3H标记的胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ），加入培养液内，则被作为DNA原料摄入到转化的细胞内，测定细胞内掺入DNA中的3H-TdR的放射性相对数量（以脉冲数cpm表示）可用来表示转化率的高低 测定低能量3H的放射性需用液体闪烁计数器MTT法 MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色小鼠脾细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜颗粒，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，通过检测490nm处光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性。
活活/ /增殖增殖期的细胞期的细胞线粒体线粒体能量代谢能量代谢琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶MTTMTTMTTMTT掺入掺入还还原原甲臢颗粒甲臢颗粒formazanformazan细胞内细胞内/ /周围周围溶解溶解测测ODOD490490值值DMSO操作流程第一天1. 杀鼠、 取脾、捣碎、 获得细胞、 计数 2.细胞稀释（1107）， 上样 （100ul/孔）3. ConA 的梯度稀释，上样 （100ul /孔）4.将96孔板置于细胞培养箱，做好标记，5%CO2 37培养48小时第三天 1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔2. 5% CO2 37，继续培养2小时3. 2000rpm，离心10min小心弃去上清，加入100ul/ 孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解4.酶标仪测吸光度值：OD490nm5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值1W无菌取脾研磨成单细胞悬液+1640（无FBS)细胞计数【?/ml】取20ul细胞+980ul的1640混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝加板(三复孔)(加法见附图)调细胞浓度1107个 /ml5%CO2 37培养48小时培养终止前2小时加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔5% CO2 37继续培养2小时 2000rpm 10min小心弃去上清，加入100ul/ 孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解酶标仪测吸光度值：OD490nm结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值操作流程实验步骤 单细胞悬液的制备1.小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。
2.于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml无血清1640培养液的平皿内3.用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱网然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中，剩余3ml培养液备用4.2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞 细胞计数1.取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后2.用含血清1640培养液调细胞浓度至1107/ml，每组所需总量为4ml（此步可使用之前装无血清培养液的离心管）实验步骤查出四个大方格（16个小方格/大格）的总细胞数(X)；算出每个大方格的细胞数：A=X/4每个大方格的体积为：V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=A 104稀释倍数(100)细胞培养1.按图所示加板。
2.将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%CO2培养箱中，培养48小时MTT掺入：1.在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况2.每孔内加入MTT（5mg/ml) 20ul，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀3.在37 5%CO2培养箱中继续培养2小时，取出板，观察颜色变化，然后离心2000rpm，10min，轻轻吸去上清，注意不要将孔底部的颗粒物吸出）观察板底是否有蓝色的颗粒4.加入100ul 二甲亚砜（DMSO)，轻轻晃板，将颗粒完全溶解结果测定：1.结果测量：用酶标仪测定490nm处光密度值（OD490nm），记录结果2.结果判定： SI（刺激指数）=ConA刺激孔值 /对照孔值ConA的倍比稀释100L ConA 200ug/ml400L 含10%血清的16401 2 3 4 5 6 7 900L含血清的1640 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 0.157 ug/ml 0400L 含10%血清的1640123547601 1 1每个样品设置三复孔 100ul spleen Cell+100ul ConA 20ug/ml100ul spleen cell +100ul ConA 10ug/ml100ul spleen Cell+100ul ConA 5ug/ml100ul spleen Cell+100ul ConA 2.5ug/ml100ul spleen Cell+ 100ul ConA 1.25ug/ml100ul spleen Cell+100ul ConA 0.625ug/ml100ul spleen Cell+100ul ConA 0.313ug/ml100ul spleen Cell+100ul 10% 1640“0”为培养基对照孔，颜色应逐渐变浅 2 2 23 3 34 4 45 5 56 6 67 7 70 0 0 加 板 方 法结 果 处 理算出SI值，用Excel作图，横坐标为ConA的浓度，纵坐标为SI值，要求带标准误差线。
把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用Excel作的图一起贴到实验记录本上要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项Excel 作图。