肺腺癌患者血清生物标志物的筛选研究 【摘要】 目的 采用SELDI-TOF-MS技术探讨肺腺癌患者血清蛋白标志物，并建立一个稳定、简便、快速的实验方法方法 肺腺癌患者321例和正常对照人群321例，按照年龄、性别、吸烟史的有无进行1:1配对，采用WCX2芯片技术进行血清蛋白质组学研究，用蛋白芯片阅读器PBSII对芯片进行扫描、分析结果 肺腺癌患者血清蛋白图谱与正常对照组相比，存在15个差异表达蛋白（P48.530的49例样本进入节点3，后用5329Da标志蛋白划分，1例判断为对照，48例判断为患者进入节点5，后用4055Da标志蛋白划分，2例判断为对照，46例判断为患者 2.4 建模后双盲筛选 随机抽取60例（30例患者、30例对照）血清，用WCX2芯片得到其蛋白质图谱后，进入该决策树模型，该模型判断认为60例中28例为肺腺癌，32例为正常和病史资料对照后，30例肺腺癌患者中26例被准确判断为肺腺癌，4例被判为正常对照；30例正常对照中25例被准确判断为正常对照，5例被判为肺腺癌决策判断模型的盲法验证的准确率为85.00%［（26+25）/60］，灵敏度为86.67%（26/30），特异度为83.33%（25/30）。
3 讨论 肺癌早期常无明显临床症状，且缺乏临床可实用的肺癌诊断、监测用标志物，极易延误诊断，因此寻找肺癌相对特异性肿瘤标志物很有必要作为肺癌诊断的传统方式，胸片及显微镜下找痰中脱落的癌细胞已临床应用了很多年但国外已有大型随机对照研究［3］发现胸片及痰找脱落细胞并不能足够早地发现肺癌，不能明显地降低因肺癌致死的危险如果能有快速、简便、易于为患者接受且准确可靠的诊断方式与高排螺旋CT可早期发现肺部小结节的优势相结合必将大大提高肺癌的早期诊断率，使患者获益新兴的蛋白质组学研究技术为满足这样的临床需求带来了希望的曙光 表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术（surface-enhanced laser desorption Ionization time of flight mass spectrometry， SELDI-TOF-MS）是一种新兴的蛋白质组学研究技术2002年诺贝尔化学奖获得者田中耕一于1993年提出该技术的基本原理，同年，美国的Bill Hutchens和Tai-Yung Yip提出了改良的表面增强激光解析电离飞行时间质谱 ［4］基于这一技术，美国的Ciphergen公司开发出了SELDI蛋白质质谱系统（Protein Chip）［5］。
使用这种技术，组分复杂的生物样品(如细胞液或体液)中的各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白质芯片上，用激光脉冲辐射使结合在芯片上的蛋白质解析形成荷电离子，这些不同质荷比的离子在真空电场中飞行的时间长短不同，据此绘制出质谱图，可以简便、快速地获得各种蛋白质的分子量、丰度等信息将正常人样本的图谱信息同某种疾病患者相比较，就有望发现新的疾病特异性相关蛋白质［2，6］SELDI技术的突出优势在于: 可以分析低分子量(<250OODa)蛋白质，低浓度（fmol级）蛋白质信息，并且可以测定疏水蛋白质，特别适于筛选疾病标志物2001年底以来，国外采用该技术获得了乳腺癌［7，8］、前列腺癌［9］等肿瘤标志蛋白，且灵敏度、特异性较强 肺腺癌是一种多基因、多步骤的复杂性状的疾病，包含了多个基因突变的分子事件过程，如抑癌基因的功能丧失、癌基因的活化等因此，用单个或数个因子的检测进行肺腺癌的早期诊断必定不可避免地存在灵敏度和特异性的矛盾蛋白质组学能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质， 提供了一组蛋白质的功能及其模式的信息，能够同时反映细胞内部的遗传特性和外界因素的影响结果［10］ SELDI质谱技术是一种新的蛋白质组学的方法，能够同时检测标本中大量的蛋白质，为较整体的检测提供了可能。
本研究应用SELDI质谱技术筛选出了5个肿瘤标志蛋白峰，相对分子量分别为4055Da、4211Da、4959Da、5329Da、7762Da，以峰值比1.5为界值时， 其诊断肺腺癌的灵敏度分别为90.41%、78.08%、50.68%、57.53% 、72.60％，特异度分别为97.06%、93.44%、71.15%、76.36%、94.92％通过选择差异蛋白峰建立决策树模型，并对部分样品采用此模型进行盲法验证，其准确率为85.00%，灵敏度为86.67%，特异度为83.33%由于按照年龄、性别、吸烟史设置对照，排除了以上三种因素对结果的影响凡与芯片直接相关的平衡芯片、稀释样品、芯片上样等操作步骤均使用机械臂完成，显著缩短了检测耗时，大大提高了检测效率，更重要的是避免了手工操作带来的误差可能，减少了系统误差 筛选出的5个肿瘤标志蛋白，推测其性质有以下几种可能：肿瘤细胞表达的特异性蛋白质分子；肿瘤状态下人体免疫系统产生的特异性蛋白质分子； 肿瘤状态下人体免疫系统产生的非特异性炎性反应蛋白质分子 对于本研究中筛选出的5个肿瘤标志蛋白在某些正常人血清中也有出现的现象，笔者认为有以下可能的原因：该“正常人”处于癌前病变状态；炎症性疾病会使一些肿瘤标志物表达增加；人体免疫系统处于的非特异性炎症应激状态。
对于本研究中筛选出的5个肿瘤标志蛋白在某些肺腺癌患者血清中没有出现的现象，笔者认为有以下可能的原因：肿瘤组织本身血循环差，其所产生肿瘤标志物不能分泌到外周血中；人体免疫系统未因肿瘤状态激活 本研究筛选出的5个肿瘤标志蛋白，特别是分子量为4055Da的蛋白质峰，灵敏度达90.41％，特异度达97.06％，优于传统的肿瘤标志物且应用SELDI蛋白质质谱技术，具有几乎无创伤、简便、快捷等优势可考虑将这种技术应用于临床普查，特别是对于肺部发现小节结的诊断不明患者，意义更加突出 笔者正在对上述差异表达蛋白质进行深入研究，有可能为临床肺腺癌患者寻找到更多无创、有效的诊断、随访方法SELDI蛋白质质谱技术方法简便、快速、标本用量少，是筛选肺癌标志物的有效手段，可能具有较好的临床应用前景 【参考文献】 1 Smith IE. Screening for lung cancer: time to think positive. Lancet， 1999，35(4):86-90. 2 肖血媛，卫秀平，何大澄，等. 应用蛋白芯片技术从血清中筛选肺癌标志蛋白. 中国科学，2003，33(4):323-328. 3 Swensen SJ， Jett JR. Lung cancer screening with CT: mayo clinic experience. Radiology，2003， 226: 756-761. 4 Hutchens TW， Yip Tai-Yung. New desorption strategies for the mass spectrometric analysis of macromolecules. Rapid Commun Mass Spectrom， 1993，7:576-580. 5 The protein chip system from ciphergen biosystems inc. Transcript. Laborwelt,2001， Suppl(Ⅲ):47-49. 6 Xiao Z， Prieto D， Conrads TP， et al. Proteomic patterns: their potential for disease diagnosis. Mol Cell Endocrinol， 2005， 31;230(1-2):95-106. 7 Somiari RI， Somiari S， Russell S， et al. Proteomics of breast carcinoma. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2005，815(1-2):215-225. 8 Pawlik TM， Fritsche H， Coombes KR， et al. Significant differences in nipple aspirate fluid protein expression between healthy women and those with breast cancer demonstrated by time-of-flight mass spectrometry. Breast Cancer Res Treat， 2005，89(2):149-157. 9 Malik G， Ward MD， Gupta SK， et al. Serum levels of an isoform of apolipoprotein A-II as a potential marker for prostate cancer. Clin Cancer Res， 2005， 11(3):1073-1085. 10 Wasinger VC， Cordwell SJ， Cerpa-Poljak A， et al. Progress with gene-product mapping of the mollicutes: mycoplasma genitalium. Electrophoresis， 1995， 16: 1090-1094.第 6 页 共 6 页。