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1、第五章生物药物的酶学分析法酶学分析法原理：利用酶作为分析工具，测定样品中待测物质含量的方法称作酶法分析。 待测物质应是酶的底物，或者是酶的抑制剂、活化剂或酶的辅因子，否那么不能采用酶法 进行分析检查。酶法分析可分为终点法和反响速度法。（一）终点法，又称总变量法 根本原理：利用酶的生物催化反响，使待测物质发生转化，然后测定产物产量或底物残 余量，通过定量分析，从而明确待测物质的含量。可以是单酶反响，也可以是几种酶构成的偶联酶反响。 在生物药物分析中，终点法是最常用的酶法分析。终点法的条件必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品。 能够确定使这种酶反响接近进行完全的条件。反响中底物的减少或
2、产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测 定。在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反响就能进行定量检测。使用终点法应注意的问题1. 酶的底物专一性:绝对专一性相对专一性立体异构专一性对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对专一性的酶。假设样品中存在除待测物质外其他可作为底物的物质时，可利用偶联酶的专一性进行区别 定量分析。2. 反响的平衡对于终点法来说，要求反响接近进行完全，故对不同的酶反响须采取不同的措施使反响 进行到接近完全。假设酶反响平衡十分偏向进行方向，那么可方便的用终点法进行检测，不需进行任何处理。 假设反响的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反响不
3、能完全，因而也 就不能正常定量。为了解决这一问题，通常采取以下一些措施：对于双底物反响尽可能提高第二底物的浓度对氧化复原之类与H +有关的反响要选择适当的pH设法除去产物用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶和第二底物的再生系统偶联，那么第一底物可能完全转化为反响产物3. 反响液中的酶量对于一个具体的测定来说不同的酶反响有不同的Km值，通过米氏方程和均相溶液反响 的动力学推算和分析，可以大致得到如下的结论：对于单酶反响的酶法分析：所参加的酶量（u/ml）相当于Km （mmol）对于偶联反响的酶法分析，所参加的酶量如下：第一反响为酶量（u/ml）相当于Kml （mmol）第二反响为酶量（u
4、/ml）相当于（12） xKm2 （mmol）4. 反响产物抑制假设产物对反响本身有抑制作用，那么就会阻碍反响进行，在这种情 况下可采取将该产物除去或者和再生系统偶联的方法解决。如：激酶反响生成的ADP往往能抑制该反响，但此时假设和丙酮酸激 酶（E.C.2.7.1.40）偶联，使 ATP 再生。S + ATP(-)P +ADP丙酮酸丙酮酸激酶A磷酸烯醇或丙酮酸!1!二、反响速度法利用酶促反响进行定量分析时，多数使用终点法，只有在下 列两种情况下才使用反响速度法。1. 很难得到专一地作用并定量转化被测物质的酶或偶联指示酶 时2. 被测物及其微量时以上两种情况下，不能用终点法进行测定只能使用速度法
5、， 使用速度法可对S、抑制剂、冲动剂、辅酶等定量。r 3-DPG）定量蝴甘油酸的甘油酸FMN （黄素喋吟单核昔酸）乳酸氧化酶 FAD （黄素喋吟二核昔酸）氨基酸氧化酶 TPP （焦磷酸硫胺） 丙酮酸脱羟酶毗哆醛 毗哆胺谷草转氨酶ini抑制剂的测定抑制剂的量与反响速度的下降值成正比例：肝素的测定肝素的量与反响速度的下降值(V= AA/At)成正比标准曲线法标准曲线样品的测定管号01234512标准肝素溶 液(ml)00.20.40.60.81.0待测样 品(ml)1.01.0HiO(ml)21.81.61.41.21.01.01.0RNA(ml)11111111RNAse(ml)11111111
6、连续测定各管A300值，求出各管aA300=0.04所需的时间AtAtO Atl At2 At3 At4 At5At 测 iAt 测 2肝素含量标准曲线AtJAt。根据AtWAto计算样品中肝素含量酶循环放大分析法酶循环放大的原理和步骤酶循环（Enzyme cycling），具有化学放大作用，理论上可无 限放大其灵敏度。酶循环放大分析法是利用酶循环所设计的种 超微分析法。目前可准确定量1015-1018mol/L的生化物质。本 分析法结合三个步骤：转换反响、循环反响和指示反响。酶循环放大法的原理、步骤（超微量前列腺素的定量为例）（三步）第一步：转换反响PG + NAD+ PG脱氢曜 1、5-脱
7、检PG+NADH + H*NADH转正比*I可作循环底物NAD H 转第二步：循环反响a .酮戊二酸Glu脱氢酶Glu3任）甘油酸NADH+H+ NAD+3-E甘油醛脱氢酶nadhW=Glu（或3.甘油酸）n3-（g）甘油醛n次循环第三步：指示反响：利用终点法测Glu （或3磷酸甘油酸）的量Glu+ NAD+ -Glu凰氢慝 a.酮虞二醵标|感费Ghi正比于NADH指NIDHgNADH转=村入。11指/n如何测得循环数n?用量的NADH作为NADH转在相同条件下进行循环反响和指示反响NADH已矢D=NADH指示/nn=NADH指示/NADH已矢口（即用量的NADH己知平行做循环反响，指示反响）
8、 在这种方法中应注意的几个问题:1. 在进行循环反响之前，必须设法除去转换反响中剩余的辅酶，在上例中就是设法除去NAD+ 除去的方式：NAD和NADP的氧化型和复原型在不同的pH值下其稳定性不同，可通过调节 pH来到达目的pH2 (250) pH13 (6013)2 .在循环反响中,NAD+ NADP+ （氧化型）lh稳定10min99.9% 被破坏NADH NADPH(复原型)5min99.9%被破坏 lOOlh仍稳定循环反响：SaPaA BPb SbSaKnEaSbKmEb底物（不是辅酶）需够量4.要用量的循环底物（上例中NADH）平行做循环反响和指示反响以求得循环数n酶循环放大法的特点和
9、应用范围（一）特点三111、本方法灵敏度高，其灵敏度远远超过比色法、荧光法和放 射性同位素法。酶循环放大法1015molngnl比色法荧光法放射法检测限 lOmol101 mol10 12mol试样量一般需ug级（lOOug）反响液体积一般需ul级（lOOul）2、本法的特异性较强，在分析生物样品时，不需别离纯化, 可直接测定。样品中如含吸光性或荧光性杂质一般不影响测定, 因可充分稀释样品使干扰物的影响降为几乎0o3、循环率极高 一般NAD循环2X10小时CoA循环3X104/小时（二）应用范围1. 有循环底物参加的酶反响的底物或酶可测定NAD、NADP、CoA等2 .能与以上反响偶联的酶反响
10、的底物或酶可测定。如:G+ATP己糖激酶（HK）G-6-P+ADPG-6-PG6PDHG醛酸6P +H+NADP+ NADPH可测G、可测ATP、也可测HK酶法分析的特征适用范围专一性（选择性）灵敏度底物、辅酶、冲动剂、抑制剂（较窄）精确度迅速程度简便程度经济方面很高，原那么上容许类似物同时存在很高，可到达107克分子以下，如果和荧 光法组合在一起,也可达10一9克分子左右 一般，根据微量吸管误差决定；也取决于 组合的方法一般，酶反响本身多在30分钟以下；通 常不需要进行处理较差，必须有酶的操作训练（温度、pH 等确实定很重要）一般，由于酶用量很微，故不会太贵1=1 1II 1=酶法分析与酶活
11、力测定的异同相同点：二者均使用了酶促反响不同点：测定的目的物不同，实验设计不同酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须是限速因素，而底物和辅酶等必须过量；酶法分析中待测物不是酶，而是底物或辅酶或抑制剂或冲动剂等等。因而必须使待测物成 为该反响的限速因素。因此二者是不相酶法分析与酶活力测定的异同同的，不能混为一谈。第六章抗生素药物的分析一、抗生素药物1、抗生素抗生素是指在卑微浓度下即可对某些生命活动有特异抑制作用的化学物质。抗生素主要是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或 杀灭作用。El抗生素药物的检查工程包括：鉴别试验异常毒性试验无菌试验 热原试验降压试验酸碱度试验水
12、分测定 溶液澄清度检查 效价测定 其他检测（抗生素组分、有关物质、比重度、 熔点、晶型、溶媒残留量、重金属、溶出度等）。抗生素效价单位抗生素效价的标示量，原那么上应按所含特定的抗菌活性局部的重量来计算。在应用中，抗生素类药物有效成分的表示方法，是按照各种抗生素的特点及使用经验，采用 符合客观实际的效价单位表示。常用的抗生素效价单位有重量单位、类似重量单位、重量折算单位、特定单位。!1!（1）重量单位 以抗生素中所含特定的抗菌活性局部（纯游离碱或游离酸）的重量lug 作为I单位，即lmg=1000单位。如链霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素、庆大霉素、土霉素；氯霉素、新生霉素酸、利福霉 素SV等均以
13、重量单位表示。用这种方法表示，对不同有机酸根的同一抗生素，只要单位一样或有效局部重量一样，那么这 一抗生素的各种盐类虽然称重不同，但实际有效含量是相同的。（2）类似重量单位 以特定的纯抗生素制品盐的重量lug作为一个单位，即lmg = 1000 单位，其中包括了无抗菌活性的酸根在内。如四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）。这种类似重量单位，虽然并不合理，但在国际上已经习惯沿用。（3）重量折算单位以特定的纯抗生素制品的某一重量为一个单位而加以折算。如青霉素国际标准品（1952年）青霉素G钠称重0.5998 Ug为1单位，即1 mg=1670单位, 那么80万单位的青霉素G钠称重应为0.48
14、go（4）特定单位 以一特定量的抗生素标准品（或对照品）作为1单位。如第一批杆菌肽国际标准品（1953年）杆菌肽A为lmg=55单位。制霉菌素（1963年）为lmg=3000单位等。这类抗生素的效价单位的精确定义很难确定，折算效价也难以计算，只能以国际标准品的效 价单位，作为比拟的基准。目前，抗生素的剂量原那么上以纯品的重量表示，并加注单位。如土霉素0.25g（250000单位）； 但个别品种仍以习惯沿用，如青霉素仍用单位表示剂量。第二节B-内酰胺类抗生素的分析一、结构及分类O氢化嚏喳环OCOOH6-氨基青霉烷酸（6-APA）；青霉素类;OCOOH7.氨基头抱菌烷酸（7-ACA）；头弛菌素类;=|理化性质1、酸性与溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不稳定性一、结构特点与性质（一）愈基酸性与碱金属（Na+、K+）成盐；与有机碱（普鲁卡因）成盐;（二）手性碳旋光性青霉素类 C3 C5 C6 ；头泡菌素类C6 C7（三）共貌体系：青霉素类 母核无明显UV多数有苯环取代
