生殖干细胞课件

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1、在多细胞生物的胚胎发育过程中，原始生 殖细胞是最 早分化出来的一群细胞，即生殖干细胞(germ stem cells)。这群细胞的出现，在多种动物中已证明与卵子 内(germ plasm)的分布密切相关。由于在线虫、昆虫等 生物的卵细胞内，其生殖质位于卵子的后极，故又称 极细胞质或极质(pole plasm)，已于80多种动物(8个门) 中发现了类生殖质成分的存在。 第二章 配子发生与发育前的准备 生殖干细胞课件 生殖质由RNA和蛋白质组成，均为 母体效应基因转录或翻译的产物。 在卵子发生过程中，不同生物的母 体效应基因以多种方式被激活并进 行高效表达，将大量产物储藏在卵 母细胞内，为受精后迅

2、速启动胚胎 发育做了充分的物质准备。 生殖干细胞课件 2.1 配子发生 配子发生涉及到原始生殖细胞起源 的方式、途径，参与调控、决定的 有关基因。 原始生殖细胞独立于性腺原基产生 ，但必须迁入性腺后才能完成增殖 、生长和成熟等发育阶段。 生殖干细胞课件 2.1.1原始生殖细胞的起源与决定 动物卵裂有多种方式和类型，因种类不同 而存在明显的差异。然而，无论采用哪种 卵裂方式，通过细胞不断分裂和增殖最终 将导致细胞之间的分化，首先是原始生殖 细胞从胚细胞中分化出来。 生殖干细胞课件 不对称细胞分裂能使所产生的两个子细胞 出现发育途径的分歧； 部分卵裂球内发生染色体消减而另一部分 则保持完整会直接导

3、致体细胞与种系细胞 之间的分化； 某些母体效应基因的转录、表达产物在卵 子内局部差异分布对原始生殖细胞的形成 具决定作用。 生殖干细胞课件 2.1.1.1不对称细胞分裂与生殖细胞的起源 在某些动物的受精卵中，母体效应基因的 产物如RNA和蛋白质所组成的RNP颗粒等 发育决定因子呈不均匀的区域分布。当卵 裂时，这些决定因子被不均等地分配到子 细胞中，导致两个细胞具有不同的发育潜 能并朝着不同方向演变。这种细胞分裂方 式称为不对称细胞分裂(Asymmetrical cell division)。 生殖干细胞课件 在卵裂早期，每一次不对称分裂产生一个 建立者细胞(Founder cell)和一个干细

4、胞 (stem cell)。前者将朝被决定的方向产生分 化的细胞后代(体细胞或生殖细胞)，后者则 继续通过不对称分裂形成新的建立者细胞 和干细胞。 这些建立者细胞是由卵子内的发育决定因 子预先决定的，其子细胞将按既定的发育 程序进行自主发育，不受环境变化的影响 。 生殖干细胞课件 角贝的受精卵在第一次卵裂前期，于植物极伸出 一个突起的泡状结构，称为极叶(Polar lobe)。第 一次卵裂完成后，一个子细胞得到全部极叶的细 胞质，另一个子细胞则不含极叶成分。第二次卵 裂前期，含极叶的那个子细胞像第一次卵裂一样 又产生两个不同的子细胞，而不含极叶的子细胞 同样进行第二次卵裂。 经过多次卵裂之后，

5、凡获得含极叶细胞质的子细 胞将分化成原始的生殖细胞，而不含极叶细胞质 的子细胞将朝体细胞的方向分化。 通过角贝卵裂过程中极叶的形态变化可以直接跟 踪观察和证明不对称细胞分裂与原始生殖细胞起 源之间的因果关系。 生殖干细胞课件 2.1.1.2染色体消减 马蛔虫(Parascaris equorum) 2n=4，是染色体数 最少的一种多细胞动物。虽同为线虫，但马蛔虫 原始生殖细胞的发生走的是另一条不同的途径。 1904年， T.Boveri发现马蛔虫第二次卵裂前中期 ，动物极分裂球的染色体碎裂成断片且大多丢失 ，原来的染色体仅一部分保留下来。这种现象称 染色体消减(Chromosome dimin

6、ution)。这些细 胞因此丢失了许多基因(Tobler et al., 1972)。与 此同时，植物极分裂球的染色体却保持完整。 生殖干细胞课件 第三次分裂时，动物极细胞沿子午线分裂 而植物极细胞仍沿赤道板分裂。然而第三 次卵裂之前，靠近动物极的那个植物分裂 球在分裂后期同样要进行染色体消减，故 4细胞期唯有最植物极那个细胞才具有完 整的染色体组。 经过4次卵裂形成16个细胞后，其中仅2个 细胞保持4条染色体完整，将成为生殖干 细胞；其余细胞均含有消减染色体，便成 为建立者细胞，朝体细胞的方向分化发育 。 生殖干细胞课件 2.1.1.3极质、极粒与生殖细胞决定 昆虫卵子后端的极细胞质与生殖细

7、胞决定 相关的现象最早由Hegner(1911)报道，他发 现极细胞形成之前，若除去或毁坏甲虫卵 的极细胞质区，胚胎发育就不能形成生殖 细胞而导致成虫不育。 Geigy(1931)证明，用UV照射果蝇卵的极细 胞质则产生不育的果蝇。 生殖干细胞课件 Okada和同事(1974)将供体正常的未经辐 射的极质注射到辐射过的受体卵的后端， 结果能挽救果蝇的不育性。该项研究还表 明，极质以其内含有颗粒状结构为特征， 这些颗粒称为极粒或P颗粒(Polar granules)，而其它部位的细胞质则没有极 粒，也不具有逆转其不育性的功能。 由此可见，极质内的P颗粒直接与生殖细 胞决定相关联。 生殖干细胞课件

8、 关于极质的研究，近期主要集中于果蝇。 果蝇的原始生殖细胞称为极细胞(Pole cell) ，由数个细胞核迁移至卵后端极质内然后 细胞化而成，是胚胎中最早分化形成的细 胞。这些极细胞形成时，将极质内的极粒 包裹于内。 极粒含蛋白质和RNA，包括生殖细胞决定 因子。这些决定因子是母体效应基因的产 物，如oskar基因的表达产物OSKAR蛋白 等。 生殖干细胞课件 若将OSKAR注射到卵子前端下方，可诱导 极细胞在胚前端异位发生(Ectopic) ，但前 端产生的极细胞不能进入生殖腺。 由此可见，合胞期的胚核是全能的，能分 化成任何类型的细胞。达到后极的无论是 哪些核，都是最早形成的细胞，并与极质

9、 相结合变成配子的前体。 生殖干细胞课件 果蝇极质的成份之一是无生殖细胞基因 (germ cell-less, gcl)的mRNA。 野生型gcl基因在成蝇卵巢中的滋养细胞内转录 ，其mRNA被输送进卵子的最后部，成为极质的 一部分,并于卵裂早期翻译成蛋白质。相反，纯 合突变蝇(gcl-gcl-)所产的卵子和胚胎中则检测 不到该基因的产物。 跟踪观察表明，gcl编码的蛋白质进入了细胞核 内，它对于极细胞的产生至为关键。当把gcl信 使的反义RNA导入胚内时，同样会失去产生生殖 细胞的能力。 2.1.1.4 极粒的主要成分与母体效应基因 生殖干细胞课件 极质成份的第二组候选者是oskar和nan

10、os等 基因的产物，其中OSKAR蛋白最关键，因 为将oskar mRNA注射到胚胎的其它部位就 会导致该区域的细胞核形成异位的原始生 殖细胞。 OSKAR还与生殖细胞产生的数量有关，如 果卵母细胞内的oskar mRNA增加就会形成 更多的生殖细胞(Ephrussi and Lehmann 1992)。 生殖干细胞课件 OSKAR通过促成生殖细胞形成所必须的蛋 白质和RNAs的定位而发挥作用，nanos mRNA是受其作用的RNA之一。 NANOS是果蝇腹节形成所必需的，同时也 是生殖细胞形成所必需的。没有NANOS的 极细胞不能迁移进生殖腺，因而不能变成 配子。 生殖干细胞课件 第三个候选

11、者是线粒体的核糖体RNA (Mitochondrial ribosomal RNA，mtrRNA) 。应用辐射检测系统，Kobayashi和 Okada(1989)证明，向被UV照射过的胚胎 导入mtrRNA可以恢复该胚胎形成极细胞的 能力。 在正常卵子内，mtrRNA仅位于卵裂期胚胎 极质内线粒体的外侧，以极粒的成分出现 。mtrRNA与介导极细胞的形成有关，但后 来并没有进入极细胞内。 生殖干细胞课件 第四种极质成分是极粒组成部分但 不翻译的一种RNA (Polar granule component, pgc)。虽然pgc的确切功 能尚不清楚，但其反义DNA的转基 因果蝇的极细胞不能迁进

12、卵巢 (Nakamura et al., 1996)，可能与原 始生殖细胞向生殖嵴迁移有关。 生殖干细胞课件 是什么指引gcl mRNA、 nanos mRNA和 mtrRNA等成分定位到卵子的后端呢？至 少还发现另外有6个基因发挥了作用，它 们的突变体不能形成生殖细胞，而且也很 少形成腹节。 这些突变基因是cappucino, spire, staufen, vasa, valois和tuder。所有这些基因活跃于 卵巢并将其产物输送到生长着的卵母细胞 内。 生殖干细胞课件 极粒的装配由oskar 信使组织，该mRNA的 数量和位置决定极细胞的数量和位置。来 自仅有1份oskar拷贝的果蝇胚

13、胎在细胞囊胚 期产生10-15个极细胞，而双份拷贝的果蝇 胚胎则可产生约35个极细胞，4拷贝就会形 成约50个极细胞。 Ephrussi和Lehmann(1992)还证明，生殖细 胞将在oskar mRNA定位的任何地方形成。 如果将oskar mRNA移至胚胎的前端，极质 及原始生殖细胞将在前端形成。 生殖干细胞课件 OSKAR是极粒骨架的主要组分，VASA和 TUDOR再附着到OSKAR上形成更复杂的 空间结构并与生殖细胞决定子相结合 (Breitwieser et al. 1996)。 gcl mRNA和mtlrRNA在卵后部的定位能够 被前述种基因及oskar中的任何一种突变 所消除。

14、 在valois和tudor突变体中，开始能发现少量 gcl mRNA定位于早期胚胎的后端，但在卵 裂后期便消失了。 生殖干细胞课件 2.1.2雌雄配子的发生过程 前已述及，原始生殖细胞在多细胞动物的胚胎发 育过程中是最早分化出来的一群细胞。这些细胞 只有迁移进原始的生殖腺内继续发育才能成为成 熟的配子。 在脊椎动物胚胎发育早期，生殖嵴没有之分 ，同时具发育为卵巢或睾丸两种潜能，迁移进来 的原始生殖细胞广泛分布于内部髓质和外部皮质 。 生殖干细胞课件 如果胚胎为XY型，在主导基因sry作用下，皮质 退化，其内的原始生殖细胞发生凋亡，而髓质分 化为睾丸，其内的原始生殖细胞分化为精原细胞 (spe

15、rmatogonium)； 若胚胎为XX型，没有Y染色体及sry，则髓质退 化，其内的原始生殖细胞发生凋亡，而皮质发育 为卵巢，其内的原始生殖细胞分化为卵原细胞 (oogonium)。 生殖干细胞课件 2.2 发育前的准备 动物卵子受精之后，从卵裂至囊胚形成其细胞分裂速度 很快，细胞周期没有G1期和G2期，只有S期和M期。 在此过程中，合子基因组几乎是不活动的，那么生长、 发育所需的mRNA、rRNA、tRNA、各种酶类和蛋白质 、卵磷酯蛋白和糖元等物质从何而来呢？ 原来，在卵子发生期间，母体效应基因起着十分关键的 作用，通过它们的转录和表达，在卵母细胞中积累、储 藏了大量所需的各种物质，为启

16、动早期发育做了充分的 准备。这种发育前的准备在所有动物中普遍存在，但具 体的方式和途径各有不同。 生殖干细胞课件 2.2.1灯刷染色体与RNA转录 在某些动物卵子发生过程中，常可观察到 卵母细胞内的染色体状似灯刷，故名灯刷 染色体(lampbrush Chromosome)。在地中 海伞藻(Acetabularia metiterranea)也可观察 到这一典型的结构，而在果蝇、玉米等配 子发生过程中则可看到非典型灯刷染色体 的存在。 生殖干细胞课件 灯刷染色体是双线期同源染色体开始分离 的二价体，每个二价体由4条染色单体组成 ，之间可见染色体交叉现象。 每一染色体由轴和侧环组成，两个相近大 小的侧环从轴伸出，轴上有大小不等的染 色粒，由浓缩的染色质构成。 一个侧环平均约含100kb DNA，每个环共 有4个拷贝。蝾螈每组染色单体约含5000个 侧环，每个卵母细胞核内共有侧环约20000 个(50004)。 生殖干细胞课件 研究表明，灯刷染色体的侧环为去螺旋化 的DNA双链，是RNA活跃转录的部位。每 个侧环多为一个大的转录单元，但也有的 侧环包含几个转录单元。转录本的3端由 RNA聚