北京理工大学珠海学院2020届本科生毕业设计利妥昔单抗原液生产车间工艺设计I摘要利妥昔单抗是目前世界上治疗淋巴瘤最重要的药物之一，且近年来研究发现其在治疗肾脏疾病中也有重要应用当前我国生产利妥昔单抗的企业有限，而需求量又比较多，因此设计一间生产利妥昔单抗原液的生产车间具有非常大的市场前景本设计的工艺流程主要分为细胞大规模培养、层析纯化这两个阶段，其中选用了流加式分批补料的方式在2000L发酵罐中进行大规模生产利妥昔单抗，并在下游工艺中采用亲和层析和两步离子交换层析对利妥昔单抗进行纯化精制，目的是达到产率高、纯度高的利妥昔单抗原液根据发酵罐使用时间设计每年生产15个批次本设计内容主要包括利妥昔单抗的相关介绍，工艺流程的选择和设计，每个周期及全年的关键物料衡算和主要的热量衡算、水平衡计算和耗冷量计算，以及生产工艺流程图、设备的选型及设备一览表、车间平面布置图关键词：利妥昔单抗；发酵；层析；生产车间；设计IIAbstractRituximab is one of the most important medicine in the treatment of lymphoma around the world, and in recent years, it has also been found to have important applications in the treatment of kidney diseases. Currently, Chinas rituximab production enterprises are limited, and the demand is relatively large, so the design of a production workshop of rituximab liquid has a very big market prospect.The design process is mainly divided into cells of mass culture, these two stages of chromatography purification, which chooses the flow and type of batch feeding way for mass production in the 2000L fermentation tank rituxan, and used in the downstream process affinity chromatography and two-step ion exchange chromatography for purification of rituxan refined, purpose is to achieve high yield, high purity of rituxan concentrate. It is designed to produce 15 batches per year according to the use time of fermentation tank.This design mainly includes the related introduction of rituximab, the selection and design of process flow, the key material balance and the main heat balance, water balance and cooling calculation for each cycle and the whole year, as well as the production process flow chart, equipment selection and equipment list, workshop layout.Key words：Rituximab；fermentation；chromatography；The production workshop；designIV 目录第一章 绪论 11.1前言 11.1.1利妥昔单抗的简介 11.1.2利妥昔单抗的现状 11.2生产工艺的设计方案 21.2.1生产工艺的选择 21.2.2设计方案路线 41.3设计的意义及可行性分析 4第二章 工艺流程设计 62.1生产利妥昔单抗的质量标准 62.2生产工艺流程 62.2.1细胞培养 62.2.2产品纯化 7第三章 工艺计算 103.1物料平衡计算 103.2热量平衡计算 133.3水平衡计算 143.4耗冷量计算 14第四章 设备选型 154.1设备选型的原则 154.2设备选型 15第五章 车间布置设计 195.1设计原则 195.2车间布置设计 205.3车间布置图 20参考文献 21致谢 23附录 24第1章 绪论1.1前言1.1.1利妥昔单抗的简介利妥昔单抗（rituximab），又名美罗华，是由人源IgG1恒定区和鼠源抗CD20抗体的可变区组成的抗CD20重组人鼠嵌合型单克隆抗体[1]，能够与B淋巴细胞表面的跨膜抗原CD20识别并特异性结合，启动介导B细胞溶解的免疫反应，高效且定向产生细胞毒作用、抗增殖效应，诱导B细胞凋亡，从而使得B细胞溶解清除。
利妥昔单抗是世界上首个被批准用于淋巴瘤治疗的单克隆抗体，在非霍奇金淋巴瘤如弥漫大B细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤的治疗中取得显著疗效[2]而对于惰性非霍奇金淋巴瘤，利妥昔单抗同样也取得了良好的疗效[3]临床研究数据显示，经过使用利妥昔单抗维持治疗后，能够显著改善患者的无进展生存时间另外，在肾脏疾病中，利妥昔单抗在治疗特发性膜性肾病（IMN）、IgA肾病、微小病变肾病、狼疮肾炎等肾脏疾病中已经得到应用[4]1.1.2利妥昔单抗的现状众所周知，单克隆抗体药物的优势有靶向性强，特异性高，副作用小，安全和高效等等单抗不仅可以增强药效，同时能够减轻患者的痛苦，同时更快治愈病人的疾病然而单抗药物的使用的主要特点是用量多，费用高，一般患者长期治疗下来可能需要的费用是巨大的据官方数据显示，我国淋巴瘤类型患者中，接近60%是B细胞淋巴瘤患者，在这其中最为常见的是弥漫大B细胞淋巴瘤然而，此类淋巴瘤疾病难发现，难治疗，一直是世界上医疗届的难题，而利妥昔单抗的问世为淋巴瘤的治疗带来了希望的曙光临床数据显示，使用利妥昔单抗进行时长6~8周期的治疗，70%的患者可能治愈，利妥昔单抗为淋巴瘤患者延长了生存时间利妥昔单抗在2000年4月进入中国市场，当时的价格为100mg/10mL需要3416元，500mg/50mL则需16041元。
在2017年，利妥昔单抗列入医保，100mg/10mL价格降为2418元，500mg/50mL价格降为8298元虽然如此，但是在经过6~8个周期治疗使用下来，对大部分患者家庭来说仍无疑是巨大的负担，这是因为在中国，淋巴瘤患者大多数都是中低收入人群，其中更有高达88%的淋巴瘤患者的家庭年收入在20万元以下，而治疗所需要的高昂的费用无疑对这些低收入家庭来说是一个天文数字所幸，在2019年2月，国家药监局对外宣布——首个国产生物类似药利妥昔单抗获批上市，这是国内生物类似药生产的重大突破[5]，另外，其规格为100mg/10mL的售价约为1640元同年8月，复宏汉霖决定将其所生产的利妥昔单抗（100mg/10ml）中标价格下降为1398元/瓶，降幅约14.8%[6]此次降价，对于每一位患者而言，一个疗程注射都将节省超过5000元治疗费用，按照DLBCL患者至少6-8个疗程的治疗，每位患者将至少可以省下3万到4万元的治疗费用[7]至于其安全性，临床数据显示，注射了利妥昔单抗后产生不良反应的病例很少，仅为4.25%，而且这其中大部分都是属于中轻度的不良反应哈尔滨血液肿瘤研究所所长、中国临床肿瘤学会副理事长马军教授表示，那1552例患者用药数据表明了其与原研利妥昔单抗在安全性方面没有差别，这进一步证实了国产利妥昔单抗的安全性[8]。
由此可见，国产利妥昔单抗的上市，不仅是国内生产生物类似药的一个突破，更是为患者带来了更多生存的希望另外，虽然利妥昔单抗是安全且高效的，但是临床数据显示，有部分患者在注射利妥昔单抗后出现了不良反应，主要表现为过敏样反应但发生的不良事件通常发生在合并用药的患者中，与利妥昔单抗的因果关系并不十分明确不过，总体来说，利妥昔单抗的使用是安全且高效的，也能减少目前多数免疫抑制剂的使用量[10]1.2生产工艺的设计方案1.2.1生产工艺的选择近年来，生物制剂企业生产时选用的上游工艺（从种子到收获）常用有两种细胞培养模型：流加式细胞培养以及连续灌流式细胞培养流加式细胞培养的原理是根据培养的细胞对营养物质的需求，连续向发酵罐中流加浓缩营养物，而且在整个发酵过程中，没有培养基流出采用流加式细胞培养的优势在于：可重复性强、操作相对比较简单，易于放大和高产率相较于连续灌注模式，由于整个培养过程没有培养基的流出，减少了污染，不过发酵罐的尺寸限制了采用流加式细胞培养生产的产能灌流式培养是把培养基和细胞一起加入发酵罐中进行培养，在整个细胞培养过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又不断向发酵罐灌注新鲜培养基[11]。
灌流式培养的优点为其操作浓度较高，与补料分批培养相比，灌流式培养能达到10到30倍的浓度，与此同时，灌流式培养对生产空间的要求不高，但是需要消耗大量的培养基，增加人工操作成本对比之下，因为本设计选用的是以2000L发酵罐进行大规模培养，且考虑经济成本上，上游工艺选择用流加式培养，这样一来可以减少人力物力的生产成本，提高经济效益而下游工艺（从蛋白捕获到原液收获）一般是将上游收集到的单抗经过精纯及病毒的灭活得到最后的原液经离心过滤后，一般选用亲和层析或者离子交换层析进行分离纯化亲和层析法是利用抗原抗体的特异性结合进行分离纯化此法分离出的抗体纯度很高可达90%以上，可以为后续的分离节省步骤，但是缺点是费用高，载量低，线性流速有限，需低pH洗脱，protein A脱落等离子交换层析法的原理是利用目标物质带的电荷与介质带的电荷相反，根据正反电荷相互吸引，利用静电力的作用结合，然后再用高离子或改变pH的方式洗脱此法可以大大降低纯化成本，缩短纯化时间但是与亲和层析相比，其特异性较差若是将这两种分离纯化方法单独使用，则其各自的缺点不可避免若将两者结合使用，即先用亲和层析法捕获大量抗体，再经过离子交换层析进行精纯，则能够互相弥补各自的不足之处，将效率最大化。
同时，将两者结合在一起使用已经在工业上得到了广泛的应用，得到了实践的验证不仅如此，将亲和层析法和离子交换层析法结合在一起，即通过亲和层析将大部分利妥昔单抗捕获，虽然理论上得到的抗体纯度是100%，然而实际上还是会存在一些杂质，如杂蛋白质，细胞DNA碎片，接着根据蛋白质等电点的不同利用离子亲和层析法将其分离精纯，能够将经济效益最大化，得到高纯度的利妥昔单抗原液另外，离子交换层析柱的离子交换介质价格低廉，而且可以重复使用百次以上，并耐强碱，不仅如此，阳离子交换介质的抗体载量可达100g/L，可以节省介质的投入量，从而降低成本因此，使用离子交换层析的经济效益是非常高的，符合本设计的经济理念因此，在下游工艺中选择亲和层析法进行利妥昔单抗的捕获，阳离子交换层析和阴离子交换层析进行抗体的精纯综上，上游工艺选用流加式细胞培养，下游工艺选用亲和层析法进行利妥昔单抗的捕获，阳离子交。